分散固相萃取净化-超高效液相色谱-串联质谱法同时测定鱼和虾中抗生素及三苯甲烷类兽药残留


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陈兴连, 林涛, 刘兴勇, 梅文泉, 杨东顺, 李彦刚, 李茂萱, 汪禄祥

1. 云南省农业科学院质量标准与检测技术研究所, 云南昆明 650224;
2. 农业农村部农产品质量监督检验测试中心(昆明), 云南昆明 650224

收稿日期：2019-02-28

基金项目：云南省科技厅科技计划项目(重大专项计划)(2018BC005-04)

通讯联系人：汪禄祥, E-mail:982219387@qq.com

摘要：建立了分散固相萃取净化-超高效液相色谱-串联质谱法快速测定鱼和虾中3类（磺胺类、喹诺酮类、氯霉素类）18种抗生素及2种三苯甲烷类（孔雀石绿、隐色孔雀石绿）兽药残留。样品经磷酸氢二钾溶液水解分散，乙腈提取，提取液经氯化钠脱水、盐析后取乙腈层，经旋转蒸发仪浓缩至近干，残留物用甲醇定容至1.0 mL，C18和PSA（N-丙基乙二胺）填料分散固相萃取净化，过滤膜后经ZORBAX C18色谱柱（50 mm×2.1 mm，1.8 μm）分离，正、负离子多反应监测模式采集数据，同位素内标法定量。实验结果表明，20种兽药在0.2~300 μg/L范围内具有良好的线性关系，检出限为0.1~0.6 μg/kg，定量限为0.3~1.8 μg/kg，相关系数均大于0.99。在1、5和20倍定量限加标浓度水平下，平均回收率为72.5%~118%，相对标准偏差（RSD）为1.9%~9.8%。该方法具有前处理简单、检测效率高、成本低等优点，适用于鱼和虾中多类兽药残留的同时测定。

关键词：分散固相萃取超高效液相色谱串联质谱法抗生素三苯甲烷类鱼虾兽药残留

Simultaneous determination of antibiotics and triphenylmethanes veterinary drug residues in fish and shrimp by dispersive solid phase extraction purification-ultra high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry

CHEN Xinglian, LIN Tao, LIU Xingyong, MEI Wenquan, YANG Dongshun, LI Yangang, LI Maoxuan, WANG Luxiang

1. Quality Standardizing and Testing Technology Institute, Yunnan Academy of Agricultural Sciences, Kunming 650224, China;
2. Supervision & Testing Center for Farm Products Quality, Ministry of Rural Agriculture(Kunming Section), Kunming 650224, China

Foundation item: Science and Technology Project of Yunnan Science and Technology Department (Major Special Project) (No. 2018BC005-04)

Abstract: A method was established to rapidly determine 20 kinds of veterinary drug residues including three catagories of antibiotics (sulfonamides, quinolones, and chloramphenicols) and two kinds of triphenylmethanes (malachite green (MG) and leucomalachite green (LMG)) in fish and shrimp, based on dispersive solid phase extraction purification-ultra high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry. The samples were first hydrolyzed using a dipotassium hydrogen phosphate solution, and then extracted using acetonitrile. Afterward, the extraction solution was dehydrated and salted out with sodium chloride and condensed to nearly dry using a rotating evaporator. This residue was dissolved in 1.0 mL methanol. The resulting solution was purified by dispersive solid phase extraction method with C18 and PSA sorbents, and filtered through a filter. The target compounds were separated employing a ZORBAX C18 column. The mass spectrometer datas were acquired by multiple reaction monitoring (MRM) of positive and negative modes and quantitated applying the isotope internal standard method. The 20 veterinary drugs showed a good linear relationship in the range of 0.2-300 μg/L. The limits of detection and the limits of quantification were 0.1-0.6 and 0.3-1.8 μg/kg, respectively, while the correlation coefficients were greater than 0.99. The average recoveries at the three spiked levels (1, 5, and 20 times of quantitative limits) ranged between 72.5%-118%, with the relative standard deviations of 1.9%-9.8%. The advantages of method include a simple pretreatment, a high detection efficiency, and a low cost. Moreover, it is suitable for the simultaneous determination of multiple veterinary drug residues in fish and shrimp.

Key words: dispersive solid phase extraction (DSPE) ultra high performance liquid chromatography (UHPLC) tandem mass spectrometry (MS/MS) antibiotics triphenylmethanes fish shrimp veterinary drug residue

磺胺类、喹诺酮类、氯霉素类、孔雀石绿等药物具有消毒、杀菌等功效, 常作为杀菌剂和抗寄生虫药广泛用于水产养殖中, 在预防、控制和治疗水产生物病虫害、促进养殖对象健康生长、满足人类对动物性食品需求等方面做出了巨大贡献^[1-3]。但研究^{[1, 4]}证明, 磺胺类、喹诺酮类、氯霉素类抗生素蓄积于体内可诱导产生耐药性菌株, 使得可利用、有效的抗生素越来越少, 也会使肌体产生过敏反应、激素障碍变态反应。孔雀石绿在生物体内代谢降解为隐色孔雀石绿, 二者均为三苯甲烷类药物, 长期食用含有孔雀石绿及代谢物残留的水产品容易引起肝、心脏、肾、眼睛、血液、皮肤等脏器和组织慢性中毒^[5], 且三苯甲烷类及某些抗生素还具有较强的致癌、致畸、致突变的严重危害。我国农业部235号文件^[6]将氯霉素、孔雀石绿列为禁用药物, 不得在动物性食品中检出, 而甲砜霉素、氟甲砜霉素、磺胺类、喹诺酮类虽然可以合理使用, 但也规定了休药期和最大残留限量, 磺胺类药物在肌肉组织中的总量不得超过100 μg/kg, 恩诺沙星与环丙沙星之和不得超过100 μg/kg, 诺氟沙星不得超过2.0 μg/kg, 甲砜霉素不得超过50 μg/kg, 氟甲砜霉素不得超过1 000 μg/kg。由于少数人因个人私利驱使, 不遵守休药期, 擅自加大用药量或其他有效替代药较少等, 导致这些兽药在水产品中的残留时有发生^{[7, 8]}。因此, 这些药物近年来被列为水产品质量安全的重点监控项目。

目前, 检测磺胺类、喹诺酮类、氯霉素类、孔雀石绿及隐色孔雀石绿的方法有酶联免疫法^{[9, 10]}、生物法^[11]、气相色谱法^[12]、高效液相色谱法^{[13, 14]}、高效液相色谱-串联质谱法(HPLC-MS/MS)^[15-18]等。生物法及酶联免疫法虽有前处理简单、测定速度快等特点, 但前者特异性差, 易受其他结构类似药物的干扰, 且灵敏度不高; 后者灵敏度虽高, 但检测结果存在假阳性^[15]; 高效液相色谱法、气相色谱法灵敏度低, 选择性差, 目标物需衍生化反应, 且多为分类检测, 前处理复杂、耗时, 检测周期长, 成本高, 远不能满足快速发展的检测需要。近年来, HPLC-MS/MS由于其重现性好, 抗干扰能力强, 准确性和灵敏度高, 检出限低, 能在短时间内同时将多种目标物快速分离和检测, 越来越广泛地被应用于多兽药残留的分析中^[19-21]。然而, 大部分国家标准^{[16, 17]}、农业部公告^[18]等的前处理方法无法实现性质迥异的多类兽药于一个提取体系、净化体系中完成, 因此, HPLC-MS/MS的优势得不到充分发挥, 严重制约了兽药检测技术的发展。分散固相萃取(DSPE)技术是一种净化农、兽药残留较为简单, 便捷、适用范围较广的样品净化技术, 将DSPE与HPLC-MS/MS相结合, 能够解决同一样品中多类兽药分类净化, 再分别用不同方法测定的问题^[22]。由于水产品例行监测项目包含孔雀石绿、隐色孔雀石绿、氯霉素类、磺胺类、喹诺酮类20种兽药, 若按标准及公告方法, 应分为3类进行前处理及上机测定, 需耗费大量时间、人力、物力、财力, 而同时测定水产品中这20种药物残留还鲜有报道。因此, 本文以鱼和虾为研究对象, 利用超高效液相色谱-三重四极杆/线性离子阱质谱仪, 采用分散固相萃取净化技术, 通过优化提取条件、净化条件、液相色谱条件、质谱条件等, 实现了鱼和虾中4类20种兽药的同时测定, 为水产品质量安全风险监测及隐患排查提供高效、便捷、低成本的分析方法。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

1290超高效液相色谱仪(美国Agilent公司); ZORBAX RRHD C18色谱柱(50 mm×2.1 mm, 1.8 μm, 美国Agilent公司); QTRAP 5500三重四极杆/线性离子阱质谱仪(美国AB Sciex公司); 涡旋振荡器(美国Thermo Scientific公司); AE 100电子分析天平(瑞士MettlerToledo公司); TGL-15 B型高速台式离心机(上海安亭科学仪器厂); 旋转蒸发仪(德国海道尔夫公司)。

磺胺二甲异噁唑、磺胺嘧啶、磺胺甲基异噁唑、磺胺噻唑、磺胺甲基嘧啶、磺胺邻二甲氧嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺喹噁林、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺间二甲氧嘧啶、磺胺氯哒嗪、磺胺甲噻噁唑、恩诺沙星、诺氟沙星、环丙沙星溶液标准物质(10 mg/L), 孔雀石绿、隐色孔雀石绿溶液标准物质(100 mg/L), 孔雀石绿-D₅(氘代孔雀石绿)、隐色孔雀石绿-D₆(氘代隐色孔雀石绿)溶液标准物质(50 mg/L), 恩诺沙星-D₅(氘代恩诺沙星)、诺氟沙星-D₅(氘代诺氟沙星)、环丙沙星-D₈(氘代环丙沙星)、磺胺邻二甲氧嘧啶-D₃(氘代磺胺邻二甲氧嘧啶)、磺胺间二甲氧嘧啶-D₆(氘代磺胺间二甲氧嘧啶)溶液标准物质(5 mg/L), 氯霉素、甲砜霉素、氟甲砜霉素溶液标准物质(100 mg/L), 氯霉素-D₅(氘代氯霉素)溶液标准物质(5 mg/L)(均购于农业农村部农产品质量标准研究中心, 北京); 氨水(分析纯, 含量25%~28%, 国药集团化学试剂上海有限公司); 甲醇、乙腈(均为色谱纯, 德国Merck公司); 甲酸(色谱纯, 美国Sigma公司); 乙酸铵、氯化钠(均为分析纯, 上海国药集团); 磷酸氢二钾(分析纯, 国药集团化学试剂北京有限公司); 纯净水(杭州娃哈哈公司); PSA(N-丙基乙二胺)、C18填料(均为50 μm, 中国迪马科技)。

1.2 溶液配制

利用甲醇将各种兽药溶液标准物质及内标物质分别稀释为1.0及0.5 mg/L的标准储备液, 避光于4 ℃下保存。系列标准溶液用甲醇配制, 现用现配。

1.0 mol/L磷酸氢二钾溶液:取22.82 g三水合磷酸氢二钾溶于纯净水中, 定容至100 mL。

1.0 mol/L氨水溶液:称取6.80 g氨水, 溶于纯净水中, 定容至100 mL。

1.3 分析条件

1.3.1 色谱条件

此条件适用于氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素。流动相B为甲醇, A为水; 流速:0.2 mL/min; 柱温:35 ℃; 进样量:2.0 μL; 梯度洗脱程序:0~3.00 min, 95%A~5%A; 3.00~6.00 min, 5%A; 6.00~6.50 min, 5%~95%A; 6.50~8.50 min, 95%A。

此条件适用于磺胺类、喹诺酮类、孔雀石绿和隐色孔雀石绿。流动相B为乙腈, A为0.5 mmoL/L乙酸铵水溶液(含0.1%(体积分数, 下同)甲酸); 流速:0.2 mL/min; 柱温:35 ℃; 进样量:2.0 μL; 梯度洗脱程序:0~3.00 min, 95%A~70%A; 3.00~4.00 min, 70%~60%A; 4.00~6.00 min, 60%A~5%A; 6.00~8.00 min, 5%A; 8.00~8.20 min, 5%A~90%A; 8.20~10.00 min, 95%A。

1.3.2 质谱条件

离子源:ESI源; GS1(喷雾气): 55 L/min; GS2(辅助加热气): 55 L/min; 气帘气:35 L/min; 辅助加热气温度:550 ℃。氯霉素类药物为负离子模式扫描; 喷雾电压:-4 500 V; 监测模式:-MRM。磺胺类、喹诺酮类、孔雀石绿、隐色孔雀石绿为正离子模式扫描; 喷雾电压:5 500 V; 监测模式:+MRM。

1.4 样品前处理

从农贸市场购买草鱼、鲤鱼、罗非鱼、鳙鱼和对虾等鲜活水产品, 取鱼可食用部分用组织捣碎机均质混匀; 将虾去头、去壳, 用组织捣碎机均质混匀, 分别装入聚乙烯瓶中于-18 ℃冷冻保存, 测定前解冻样品, 称取5.00 g(精确至0.01 g)于50 mL离心管中, 加入5.0 mL磷酸氢二钾溶液, 涡旋15 s将样品分散后再加入3~5 g氯化钠和12.5 mL乙腈, 涡旋提取5~8 min, 超声8 min, 以5 000 r/min的速度离心3 min后将上清液转移至150 mL圆底烧瓶中, 再加12.5 mL乙腈重复提取一次, 两次提取液合并, 于45 ℃旋转蒸发仪上浓缩至近干, 加入1.0 mL甲醇复溶后转移至10.0 mL离心管中, 分别加入30 mg C18和50 mg PSA填料, 涡旋30 s, 取上清液过0.22 μm有机相滤膜, 待上机分析。

2 结果与讨论

2.1 色谱和质谱条件优化

2.1.1 质谱条件的选择

用液相色谱-串联质谱法对1.1节中20种兽药残留检测的文献及标准较多, 但是不同厂家生产的质谱仪及相同厂家生产的不同型号的质谱仪结构不同, 得到的碎片离子响应强度及电压不同。在质谱分析中, 对于化合物的电离影响较大的主要是去簇电压(DP)和碰撞电压(CE)。本研究在标准^[16-18]的基础上, 采用0.5 mg/L的20种兽药混合标准溶液及8种混合同位素内标溶液, 通过针泵以流动注射的方式进样, 为每个待测药物选取响应最高的两对离子对及相应的解簇电压(DP)和碰撞能量(CE)作为最终的质谱采集参数, 并根据各离子的响应高度确定定量与定性离子, 相关参数见表 1。

表 1 120种兽药标准及8种同位素内标的相关质谱参数 Table 1 Mass parameters for the 20 veterinary drug standards and 8 isotope internal standards

Compound	Retention time/min	Precursor ion (m/z)	Product ion (m/z)	Declustering potential/V	Collision energy/V
Sulfisoxazole	4.42	268	156^*/113	45	20/23
Sulfadiazine	2.47	251	156^*/185	55	23/27
Sulfamethoxazole	4.21	254	156^*/147	50	23/22
Sulfamerazine	2.97	265	156^*/172	50	25/24
Sulfadoxine	4.13	311	156^*/108	70	31/35
Sulfamethazine	3.35	279	156^*/204	55	22/20
Sulfachinoxalin	4.86	301	156^*/108	55	24/37
Enrofloxacin	3.28	360	316^*/245	80	28/36
Norfloxacin	2.96	320	276^*/233	80	26/35
Ciprofloxacin	3.05	332	288^*/245	80	25/33
Sulfamonomethoxine	3.76	281	156^*/215	65	25/25
Sulfadimethoxine	4.86	311	156^*/108	70	31/35
Sulfachloropyridazine	3.94	285	156^*/108	50	23/35
Sulfathiazole	2.67	285	156^*/108	70	19/30
Sulfamethizol	3.35	271	108^*/92	60	33/36
Sulfadoxine-D₃	4.10	314	156	70	31
Sulfadimethoxine-D₆	4.83	317	156	70	31
Enrofloxacin-D₅	3.27	365	321	90	30
Norfloxacin-D₅	2.95	325	307	80	26
Ciprofloxacin-D₈	3.04	340	322	90	30
Malachite green-D₅	5.84	334	318	66	54
Leucomalachite green-D₆	7.30	337	321	66	32
Malachite green	5.84	329	313^*/208	101	53/46
Leucomalachite green	7.33	331	239^*/315	76	45/32
Chloramphenicol	3.11	321	152^*/257	-70	-24/-17
Thiamphenicol	2.42	354	185^*/290	-75	-28/-16
Florfenicol	2.74	356	336^*/185	-70	-14/-27
Chloramphenicol-D₅	3.26	326	157	-75	-22
* Quantitative ion.

表 1 120种兽药标准及8种同位素内标的相关质谱参数 Table 1 Mass parameters for the 20 veterinary drug standards and 8 isotope internal standards

2.1.2 色谱分离条件的选择

4类兽药的极性差异较大, 同类化合物又因结构相似不易分离, 尤其是其中同分异构体的分离, 且喹诺酮结构中含羧基及酮羰基, 极易与Fe³⁺、Al³⁺、Ca²⁺等金属离子形成配合物, 造成峰拖尾、展宽、保留时间漂移等现象, 这些都是药物多残留同时分析中色谱分离条件优化的难点^[23]。为使20种药物均达到最佳的分离效果, 本试验以例行监测抽取数量较多的鲤鱼、草鱼、罗非鱼、鳙鱼和对虾为研究对象, 将20种兽药的混合标准溶液及8种内标溶液加入5种样品基质中处理后上机测定, 分别比较甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.1%甲酸水溶液、乙腈-0.1%甲酸水溶液、甲醇-0.1%甲酸水溶液(含0.5 mmol/L乙酸铵)、乙腈-0.1%甲酸水溶液(含0.5 mmol/L乙酸铵)对色谱分离和质谱灵敏度的影响, 结果如下。

(1) 对于磺胺类、喹诺酮类、孔雀石绿及隐色孔雀石绿, 无论流动相为甲醇还是乙腈, 灵敏度均高于标准^[16-18], 但以甲醇为流动相时, 样品中环丙沙星内标物峰受杂质干扰较大, 因此影响环丙沙星内标法定量结果的准确性; 而当换为乙腈时, 干扰杂质峰与目标物峰能达到基线分离, 如图 1所示, 所以选乙腈为流动相; 而对于氯霉素类, 甲醇做流动相时, 3种药物响应都比乙腈高, 在设定的梯度条件下也均能达到基线分离且目标物峰不受杂质干扰, 因此流动相选择甲醇。

图 1 环丙沙星-D₈在不同流动相中的色谱图 Fig. 1 Chromatogram of ciprofloxacin-D₈ in different mobile phases

(2) 对于磺胺类、喹诺酮类、孔雀石绿及隐色孔雀石绿, 水相中加入甲酸时, 分析物的峰形尖锐, 灵敏度显著提高。经对甲酸的添加浓度反复试验, 最终选择含0.1%甲酸的水溶液作为水相, 可以获得较好的效果。原因可能是这3类药物均呈弱碱性, 加入酸可促使目标化合物带电, 提高待测物在电喷雾离子源中的正离子化效率, 促进[M+H]⁺峰的形成, 因此提高了质谱响应。含0.1%甲酸的水溶液中再加入乙酸铵后, 大多药物响应值进一步增高, 药物的峰形也得到不同程度改善, 可能是乙酸铵的加入抑制了[M+Na]⁺峰形成, 再次提高了质谱响应; 此外流动相的pH值对峰形有较大影响, 而不同的样品基质酸碱度不同, pH也不同, 在流动相中加入乙酸铵还可缓冲pH值的变化, 因而改变了不同基质样品中药物的峰形。氯霉素类药物用纯水做流动相时共流出物较少, 避免了样品中干扰杂质对药物离子化的抑制, 所以响应更高^[24]。因此, 本试验中磺胺类、喹诺酮类、孔雀石绿、隐色孔雀石绿最终采用乙腈-0.5 mmoL/L乙酸铵水溶液(含0.1%甲酸)为流动相, 氯霉素类最终采用甲醇-水为流动相, 20种药物的MRM总离子流图见图 2。在图 2a中, 虽然保留时间相近的药物存在色谱峰重叠的现象, 但由于这些药物的监测离子不同, 提取离子后的峰不受干扰, 故不会对其定性、定量结果产生影响。

图 2 20种兽药的MRM总离子流色谱图 Fig. 2 Total ion current chromatogram of the 20 veterinary drugs obtained by MRM a. sulfonamides, quinolones, malachite green and leucomalachite green; b. chloramphenicols.

2.2 前处理条件优化

2.2.1 提取溶剂

选择阴性鱼、虾样品为实验材料, 考察了乙腈、乙酸乙酯2种提取溶剂对20种药物的提取效果。结果表明, 乙酸乙酯对部分药物提取效果较差, 且样品中的蛋白质、脂肪、色素等干扰物易溶于乙酸乙酯, 造成基质效应较强, 干扰严重, 也不利于后续净化。而乙腈对组织渗透力强, 对目标物提取效果好, 且沉淀蛋白质及脂肪能力强, 共提物少, 基质效应相对较弱^{[25, 26]}, 因此本试验选取乙腈作为提取溶剂。

2.2.2 样品分散试剂及加入体积

鱼、虾均为高蛋白质样品, 加入乙腈后由于蛋白质变性, 样品脱水, 导致大量样品迅速结块, 从而影响兽药的提取效率。因此, 本试验首先于5种样品基质中分别加入5.0 mL水、5.0 mL(1.0 mol/L)磷酸氢二钾溶液、5.0 mL(1.0 mol/L)氨水, 涡旋将样品分散后再加入25.0 mL乙腈, 考察各类兽药的提取效果。结果表明, 由于水或碱溶液的加入, 样品结块现象得以消除, 但加入碱溶液的样品涡旋后分散效果更好, 且大多兽药回收率也高于加水的样品, 其中加1.0 mol/L磷酸氢二钾溶液的样品兽药回收率最高。可能的原因是水具有良好的组织渗透性, 涡旋后能起到匀浆的效果, 所以样品不再结块。此外, 碱再促使样品发生水解, 因此, 加碱溶液的样品分散性更好, 与有机溶剂接触面积更大, 对药物提取更加充分; 碱还能促进药物与结合蛋白质解离, 从而使二者提取效率高于加水的样品。其中带多电荷阴离子盐的解离效果好于单电荷阴离子盐, 因此加磷酸氢二钾溶液的样品回收率高于加氨水的样品, 表 2为以鲤鱼为例的试验结果。

表 2 加入水、1.0 mol/L氨水溶液和1.0 mol/L磷酸氢二钾溶液对鲤鱼中20种兽药提取率的影响 Table 2 Effects of the addition of water, 1.0 mol/L ammonia solution and 1.0 mol/L hydrogen dipotassium phosphate solution on the extraction rates of 20 veterinary drugs in the carp

Compound	Water/%	1 mol/L ammonia/%	1 mol/L dipotassium hydrogen phosphate solution/%
Sulfisoxazole	49.4	95.0	107
Sulfadiazine	65.4	54.9	104
Sulfamethoxazole	61.6	136	109
Sulfamerazine	68.9	171	108
Sulfadoxine	74.5	62.3	113
Sulfamethazine	71.1	102	112
Sulfachinoxalin	79.8	114	102
Enrofloxacin	54.1	97	116
Norfloxacin	40.2	107	101
Ciprofloxacin	45.5	88.9	98.9
Sulfamonomethoxine	79.9	43.5	113
Sulfadimethoxine	78.3	116	108
Sulfachloropyridazine	66.3	107	118
Sulfathiazole	58.8	132	99.2
Sulfamethizol	61.4	112	89.8
Malachite green	46.7	61.9	107
Leucomalachite green	70.2	88.4	94.9
Chloramphenicol	88.3	103	105
Thiamphenicol	89.4	115	106
Florfenicol	92.6	87.5	112

其次, 还考察了加入1.0、3.0、5.0、7.0和9.0 mL 1.0 mol/L磷酸氢二钾溶液对20种兽药回收率的影响。结果表明, 当加入1.0和3.0 mL磷酸氢二钾溶液时, 样品匀浆效果较差, 尤其是对虾, 涡旋后仍难以将样品完全分散开来; 当加入量为5.0 mL时, 5种样品均能均匀分散, 不同样品中各种兽药的提取效率也达到最高, 随着磷酸氢二钾溶液加入量的增加, 环丙沙星、孔雀石绿等的提取效率逐渐降低, 因此本试验选择加入5.0 mL 1.0 mol/L磷酸氢二钾溶液为样品分散剂。

2.2.3 萃取盐

为使样品充分分散而加入了磷酸氢二钾溶液, 由此将大量水带入提取液中, 若不将这些水分离, 将严重影响萃取液的浓缩效率。于是在样品中加入盐以将水吸附或使水与乙腈分层后再取乙腈层浓缩, 这样可大大缩短提取液浓缩时间。据于此, 考察了无水硫酸镁、无水硫酸钠和氯化钠的除水效果及其对兽药回收率的影响。通过样品加标试验发现, 使用无水硫酸镁或无水硫酸钠时, 乙腈和水不分层, 提取液浓缩到最后仍余下部分水, 但加大盐的用量时诺氟沙星、环丙沙星等药物易被吸附, 且被提取出的大量杂质也仍留于乙腈中, 在浓缩的过程中, 若压力控制不合适, 被提取出的杂质会促使提取液产生大量泡沫而喷出浓缩瓶外。而加入氯化钠使水相达到饱和后再离心, 水与乙腈分层明显, 上层乙腈浓缩时所需时间大大缩短, 大部分兽药的回收率也优于使用无水硫酸镁和无水硫酸钠, 且氯化钠对药物没有明显的吸附现象; 此外, 由于氯化钠的盐析作用还促使水相中的兽药分配到有机相中, 同时有机相中的蛋白质等大量杂质沉淀于水相, 从而使药物与大量杂质分离, 提取液浓缩过程中不易产生大量泡沫而溢出瓶外, 提高了浓缩时的效率, 还大大减少了提取液损失, 因而降低了方法的检出限, 因此选择于样品中加入约3~5 g氯化钠, 使水相达到饱和即可。

2.2.4 提取试剂加入量及提取次数

在前几步试验的基础上, 先于各个样品中加入5.0 mL(1.0 mol/L)磷酸氢二钾溶液将样品分散后, 再加提取试剂以考察乙腈加入量及提取次数对各类药物回收率的影响。先以5.0、10.0、15.0、20.0、25.0和30.0 mL乙腈分别对各样品中的兽药进行提取。结果表明, 随着乙腈加入体积增加, 各个样品中药物回收率也随之增加, 当加入量为25.0及30.0 mL时, 20种兽药回收率均达到最高, 但环丙沙星最高回收率不足50.0%, 当提取剂为30 mL时, 萃取杂质较多, 干扰较大。试验中又将样品离心后的下层水相过膜测定, 发现下层水相中含有约40.0%的环丙沙星, 于是将25.0 mL提取试剂分为两次萃取, 每次使用12.5 mL, 此时环丙沙星回收率提高到80.0%以上, 其余药物在平行样中的测定结果也更加接近, 所以选择每次使用12.5 mL乙腈提取两次。

2.2.5 净化材料

首先将提取液浓缩、定容后直接进样分析, 结果表明, 部分药物在不同样品基质中的平均回收率差异较大, 且有部分基质中磺胺噻唑、磺胺甲噻噁唑、恩诺沙星等药物超出70.0%~120%的范围。其原因可能是存在一定的基质增强或减弱效应, 且不同的样品基质增强或减弱的程度不同, 同时虾、鳙鱼等样品提取液浓缩后颜色相对较深, 易对仪器造成污染。由于鱼和虾中的干扰物主要是脂肪、蛋白质、色素等, 而PSA对样品中的一些强极性杂质、脂肪酸、色素等具有良好的净化效果, C18粉对样品中的蛋白质和脂类成分有较好的吸附效果^[27]。为使样品中的杂质得到有效去除的同时各样品中20种兽药的回收率也达到最高, 将PSA与C18共80 mg分别以6:2、5:3、4:4、3:5、2:6的质量比用于提取液的净化。结果表明, 不同的质量比对杂质去除效果不同, 各药物的回收率也不同, 当PSA与C18质量比为5:3时, 各样品中兽药回收率最高, 且20种药物均在70.0%~120%(见表 3)。因此, 选质量比为5:3的PSA与C18共80 mg作为本试验的净化材料。

表 3 鱼、虾样品提取液净化前、后20种兽药的回收率 Table 3 Recoveries of the 20 veterinary drugs in the extracted solutions of fish and shrimp samples before (BP) and after (AP) purification

Compound	Carp		Grass carp		Tilapia		Bighead		Prawn
Compound	BP/%	AP/%	BP/%	AP/%	BP/%	AP/%	BP/%	AP/%	BP/%	AP/%
Sulfisoxazole	103	101	89.8	86.9	86.0	86.9	89.1	94.3	90.3	76.5
Sulfadiazine	86.3	90.2	84.5	85.4	113	112	87.7	82.5	85.8	84.6
Sulfamethoxazole	101	100	90.5	94.3	90.4	89.7	96.3	102	87.5	74.8
Sulfamerazine	96.0	92.7	93.5	106	85.7	90.6	102	101	78.9	98.6
Sulfadoxine	96.9	92.1	96.4	109	82.2	99.8	95.5	109	91.8	103
Sulfamethazine	109	103	88.0	101	88.6	101	94.8	112	93.2	99.6
Sulfachinoxalin	108	102	105	115	95.6	117	84.6	98.9	93.9	99.6
Enrofloxacin	97.8	103	104	98.9	108	89.8	107	99.7	127	94.7
Norfloxacin	102	101	107	101	90.7	96.5	105	96.8	97.8	93.5
Ciprofloxacin	105	101	104	97.9	92.6	89.9	101	103	108	114
Sulfamonomethoxine	97.1	95.6	98.4	99.1	87.5	94.5	92.4	91.5	95.2	78.5
Sulfadimethoxine	102	98.4	101	95.1	109	102	93.3	105	103	105
Sulfachloropyridazine	100	96.9	84.8	94.2	87.7	89.9	85.9	83.9	83.1	88.6
Sulfathiazole	87.3	90.2	75.5	81.8	86.0	86.2	75.3	74.6	68.4	86.7
Sulfamethizol	62.7	73.8	68.9	81.8	71.3	82.6	66.4	74.1	56.1	73.3
Malachite green	82.9	85.1	109	118	114	115	127	97.4	84.1	87.0
Leucomalachite green	92.6	93.1	76.7	79.2	101	95.2	88.4	85.8	148	116
Chloramphenicol	88.6	89.8	96.2	98.4	77.9	85.9	109	113	81.2	87.6
Thiamphenicol	93.1	89.5	83.3	86.2	108	102	108	102	82.5	88.9
Florfenicol	98.0	92.8	97.7	102	78.3	82.5	93.6	98.9	78.9	85.4

2.2.6 加入兽药标准溶液及内标溶液与加入提取试剂间隔时间

按以往惯例, 做质控样回收率时, 常将标准溶液及相应的内标溶液加入基质中放置约10 min后再加入提取试剂进行前处理, 但本试验的20种兽药中孔雀石绿按此间隔时间在5种基质中的回收率都只有35.0%~50.0%, 通过比较药物标准与内标回收率发现, 二者的提取效率不同, 因此又考察了样品中加入标准溶液及内标溶液与加入提取试剂时间间隔为15 min、30 min、1 h、2 h、4 h、12 h和24 h时孔雀石绿的回收率。结果表明, 间隔时间越长, 孔雀石绿内标与标准提取效率越接近, 所以内标法定量时的回收率越高。当间隔时间为4 h及以上时, 回收率达到最高, 且平行样相对标准偏差最小, 为尽量缩短样品前处理时间, 本试验选择向基质中加入兽药标准及内标溶液与加入提取试剂时间间隔为4 h。

2.3 线性范围和检出限

根据各兽药在仪器上的响应值, 将20种兽药标准溶液稀释成不同的浓度, 以定量离子的峰面积对浓度进行线性回归, 同时用上述鱼和虾阴性样品为基质, 进行检出限和定量限的考察, 以3倍和10倍信噪比来确定20种药物的检出限和定量限。如表 4所示, 20种兽药在0.2~300.0 μg/L范围内线性关系较好(相关系数R²＞0.99), 检出限、定量限均比标准及公告^[16-18]方法低, 能满足水产品中多种兽药残留的测定需求。

表 4 20种兽药的线性范围、线性方程、相关系数、检出限、定量限及所对应的内标物 Table 4 Linear ranges, linear equations, correlation coefficients (R²), limits of detection (LODs), limits of quantitation (LOQs) and the corresponding internal standards of the 20 veterinary drugs

Compound	Linear equation	Linear range/(μg/L)	LOD/(μg/kg)	LOQ/(μg/kg)	R²	Corresponding internal standard
Sulfisoxazole	y=0.0649x-0.0077	1-300	0.5	1.5	0.9991	sulfadimethoxine-D₆
Sulfadiazine	y=0.0302x-0.0042	1-300	0.6	1.8	0.9987	sulfadoxine-D₃
Sulfamethoxazole	y=0.0334x-0.0020	1-300	0.5	1.4	0.9993	sulfadoxine-D₃
Sulfamerazine	y=0.0342x-0.0013	1-300	0.6	1.8	0.9975	sulfadoxine-D₃
Sulfadoxine	y=0.1140x-0.0003	1-300	0.4	1.5	0.9994	sulfadoxine-D₃
Sulfamethazine	y=0.0249x-0.0031	1-300	0.5	1.5	0.9998	sulfadoxine-D₃
Sulfachinoxalin	y=0.0956x-0.0020	1-300	0.5	1.5	0.9990	sulfadimethoxine-D₆
Sulfamonomethoxine	y=0.0349x-0.0019	1-300	0.5	1.5	0.9994	sulfadoxine-D₃
Sulfadimethoxine	y=0.1950x-0.0006	1-300	0.4	1.5	0.9990	sulfadimethoxine-D₆
Sulfachloropyridazine	y=0.0281x-0.0016	1-300	0.5	1.5	0.9999	sulfadoxine-D₃
Sulfathiazole	y=0.0337x-0.0001	1-300	0.5	1.5	0.9996	sulfadoxine-D₃
Sulfamethizol	y=0.0152x-0.0012	1-300	0.6	1.8	0.9998	sulfadoxine-D₃
Enrofloxacin	y=0.0663x-0.0008	1-300	0.4	1.2	0.9996	enrofloxacin-D₅
Ciprofloxacin	y=0.0172x-0.0076	1-300	0.6	1.8	0.9949	ciprofloxacin-D₈
Norfloxacin	y=0.0111x-0.0125	1-300	0.6	1.8	0.9989	norfloxacin-D₅
Malachite green	y=0.0603x-0.0026	0.5-100	0.3	0.9	0.9995	malachite green-D₅
Leucomalachite green	y=0.2780x-0.0031	0.5-100	0.2	0.7	0.9996	leucomalachite green-D₆
Chloramphenicol	y=0.0005x-0.0001	0.2-40	0.1	0.3	0.9987	chloramphenicol-D₅
Thiamphenicol	y=0.0004x-0.0041	0.2-40	0.1	0.3	0.9998	chloramphenicol-D₅
Florfenicol	y=0.0002x-0.0031	0.2-40	0.1	0.3	0.9993	chloramphenicol-D₅
y: peak area ratio of analyte to the internal standard; x: mass concentration of analyte, μg/L.

2.4 回收率和精密度

分别以1倍、5倍和20倍20种兽药的定量限作为添加浓度加入鱼和虾5种阴性样品中进行回收率试验, 每个样品基质做6次平行试验, 计算其平均回收率及相对标准偏差, 结果见表 5。4类兽药的平均回收率为72.5%~118%, 相对标准偏差为1.9%~9.8%, 符合兽药残留测定对回收率(70.0%~120%)及相对标准偏差(≤10%)的要求。

表 5 20种兽药在5种样品中3个添加水平下的加标回收率和相对标准偏差(n=6) Table 5 Spiked recoveries and RSDs of the 20 veterinary drugs spiked in five samples at three levels (n=6)

Compound	Spiked levels/(μg/kg)			Average Recoveries/RSDs/%
Compound	Low	Middle	High	Carp	Grass carp	Tilapia	Bighead	Prawn
Sulfisoxazole	1.5	7.5	30	97.2/3.3	102/3.2	87.4/8.5	78.2/8.1	77.4/5.2
Sulfadiazine	1.8	9.0	36	89.1/1.9	95.9/3.8	114/6.6	86.5/7.3	86.7/3.7
Sulfamethoxazole	1.4	7.0	28	102/5.3	94.1/7.1	97.9/6.3	94.6/5.9	79.2/5.3
Sulfamerazine	1.8	9.0	36	96.9/2.6	97.8/6.6	85.7/5.7	96.9/4.7	87.6/6.4
Sulfadoxine	1.5	7.5	30	98.9/6.3	98.9/5.6	88.4/6.3	96.9/3.4	104/3.6
Sulfamethazine	1.5	7.5	30	108/5.7	103/3.6	95.4/8.3	99.1/5.4	95.7/5.9
Sulfachinoxalin	1.5	7.5	30	103/3.6	109/5.8	109/5.6	89.4/7.0	106/4.8
Sulfamonomethoxine	1.5	7.5	30	97.9/6.1	104/6.3	104/5.5	104/8.2	95.3/6.2
Sulfadimethoxine	1.5	7.5	30	107/4.7	103/6.7	97.4/5.3	108/5.4	86.9/6.4
Sulfachloropyridazine	1.5	7.5	30	102/3.9	104/5.3	98.3/5.9	92.5/6.9	89.1/6.2
Sulfathiazole	1.5	7.5	30	99.5/6.2	97.0/4.6	87.7/3.2	94.8/6.3	72.5/8.5
Sulfamethizol	1.8	9.0	36	101/3.2	99.1/4.6	106/5.4	89.6/5.3	97.8/6.8
Enrofloxacin	1.2	6.0	24	105/6.1	96.0/5.8	77.8/6.1	88.3/7.3	76.4/6.1
Ciprofloxacin	1.8	9.0	36	87.3/6.7	95.5/7.1	85.4/3.7	78.9/8.2	87.2/4.3
Norfloxacin	1.8	9.0	36	95.3/7.2	84.7/4.4	75.1/7.4	79.1/5.3	88.4/6.8
Malachite green	0.9	4.5	18	82.5/8.3	88.6/4.2	118/7.8	109/9.3	85.9/8.2
Leucomalachite green	0.7	3.5	14	97.1/5.7	89.4/5.2	95.3/6.9	74.5/9.8	116/8.2
Chloramphenicol	0.3	1.5	6.0	83.8/6.9	85.8/8.5	103/6.2	74.8/7.9	83.6/7.6
Thiamphenicol	0.3	1.5	6.0	85.6/8.0	89.9/6.4	108/6.4	89.2/6.4	94.1/6.8
Florfenicol	0.3	1.5	6.0	88.7/7.6	94.2/5.9	101/4.3	77.6/7.1	79.4/6.9

2.5 实际样品检测

为验证本方法的可靠性, 同时了解市场上水产品中兽药残留情况, 采用本研究建立的检测方法对市售的5个鱼样品(鲤鱼、草鱼、鲫鱼、鲫鱼和罗非鱼)和1个对虾进行了检测, 并对数据结果进行分析。其中罗非鱼检出恩诺沙星, 含量为4.83 μg/kg; 鲤鱼检出恩诺沙星, 含量为2.16 μg/kg。将上述6个样品分别用标准^[16-18]进行再次测定, 定性结果与本文建立的方法相同, 罗非鱼中恩诺沙星含量为4.91 μg/kg, 鲤鱼中恩诺沙星为2.09 μg/kg, 可见两种方法的测定结果非常接近, 表明本法可用于鱼、虾中兽药残留的定性筛查及定量测定。

3 结论

本文建立了分散固相萃取净化-超高效液相色谱-串联质谱法同时测定水产品中磺胺类、喹诺酮类、孔雀石绿及隐色孔雀石绿、氯霉素类药物残留的方法。该方法高效、简单、灵敏, 适用于鱼和虾中多兽药残留的快速测定。与现行国家标准及农业部公告相比, 该方法能实现不同性质的多类兽药残留同时检测, 大大缩短了检测周期, 节约了检测成本, 为相关的检测机构提供了有力的技术支持。

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