色谱  2019, Vol. 37 Issue (9): 939-945     DOI: 10.3724/SP.J.1123.2019.03002   PDF    
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周秀锦
杨会成
张静
邵宏宏
冷向阳
韩超
基于肝脏代谢组分析研究低聚硒化氨基多糖对黑鲷的免疫调节作用
周秀锦1, 杨会成2, 张静1, 邵宏宏1, 冷向阳3, 韩超4     
1. 舟山海关综合技术服务中心, 浙江 舟山 316000;
2. 浙江海洋开发研究院, 浙江 舟山 316000;
3. SCIEX公司, 上海 200335;
4. 浙江树人大学生物与环境工程学院, 浙江 杭州 310015
收稿日期：2019-03-05
基金项目：国家国际科技合作专项项目(2015DFA30980)
通讯联系人：韩超, Tel:(0571)88296959, E-mail:hanchao96@163.com
摘要：采用基于液相色谱-飞行时间质谱联用（LC-TOF-MS）技术的代谢组学方法，分析黑鲷肝脏内源性代谢物的变化，研究硒化氨基多糖增强黑鲷的免疫调节机制。采用XCMSplus软件非靶向分析质谱采集数据，筛选潜在生物标志物，并通过MetaboAnalyst3.0网站分析相关代谢通路。结果表明，饲喂硒化氨基多糖组中的代谢物明显区分于空白组，发现并鉴定了32个有差异的生物标志物。代谢通路分析结果表明，硒化氨基多糖可通过氨基酰基-转运脱氧核糖核苷酸（tRNA）生物合成、氨基酸代谢、核苷酸代谢、氮代谢等代谢通路增强黑鲷自身的免疫机能。该研究为阐明硒化氨基多糖的免疫增强机制提供了科学依据。
关键词：高分辨质谱    代谢组学    低聚硒化氨基多糖    黑鲷    免疫调节    
Immunomodulatory effect of low relative molecular mass seleno-aminopolysaccharide in Acanthopagrus schlegelii by hepatic metabolomics analysis
ZHOU Xiujin1, YANG Huicheng2, ZHANG Jing1, SHAO Honghong1, LENG Xiangyang3, HAN Chao4     
1. Comprehensive Technical Service Center of Zhoushan Customs, Zhoushan 316000, China;
2. Zhejiang Marine Development Research Institute, Zhoushan 316000, China;
3. SCIEX Company, Shanghai 200335, China;
4. College of Biology and Environmental Engineering, Zhejiang Shuren University, Hangzhou 310015, China
Foundation item: International Science and Technology Cooperation Program of China (No. 2015DFA30980)
Abstract: To investigate the immunomodulatory mechanism of low relative molecular mass seleno-aminopolysaccharide, a metabolomics method based on liquid chromatography-time-of-flight mass spectrometry (LC-TOF-MS) was used to analyze the endogenous metabolites changes in the liver of Acanthopagrus schlegelii. The potential biomarkers were screened using non-targeted mass spectrometry with the XCMSplus software, and the related metabolic pathways were analyzed using MetaboAnalyst3.0 website. The results showed that the liver metabolites in the low relative molecular mass seleno-aminopolysaccharide-fed group were significantly different from those in the blank group. Also, 32 biomarkers were identified. Additionally, low relative molecular mass seleno-aminopolysaccharide could enhance the immune function of Acathopagrus schlegelii via amino acid, nucleotide, and nitrogen metabolism, aminoacyl-transfer ribonucleic acid (tRNA) biosynthesis, and other metabolic pathways. This study therefore provides a scientific basis for elucidating the immunoenhancement mechanism of low relative molecular mass seleno-aminopolysaccharide.
Key words: high-definition mass spectrometry     metabolomics     low relative molecular mass seleno-aminopolysaccharide     Acanthopagrus schlegelii     immunomodulatory    

硒作为机体必需微量元素[1], 通过硒蛋白、硒依赖酶的辅助因子等形式, 在机体生长和维持机体健康方面起着重要的作用[2-5]。目前研究较多的是生物毒性相对较小和易于被吸收利用的有机硒, 如硒化氨基多糖。硒化氨基多糖是通过化学修饰方法将多糖与无机硒结合获得[6], 硒和多糖的生理活性和药理功能得到优化, 生物活性普遍高于多糖和硒, 更易于为机体吸收和利用[7]。硒化氨基多糖可以作为增强适应性免疫性能的潜力含硒膳食补充剂[8]。

黑鲷(Acanthopagrus schlegelii)是我国东南沿海地区及太平洋西岸海水养殖的经济鱼类[9]。目前关于黑鲷对硒的利用已有初步研究[10], 但关于硒化氨基多糖对黑鲷免疫调节作用的研究较少。代谢组学能够将原始的反映样品信息的复杂数据(比如飞行时间质谱数据和核磁共振扫描数据等)经过一系列降维处理, 直接反映体内生物化学过程和状态的变化, 在系统研究生物内源性小分子代谢物整体和动态改变规律上具有独特优势[11-14]。本研究利用高通量、高灵敏度、高分辨质谱检测技术和非靶向代谢组学方法, 阐释硒化氨基多糖对黑鲷免疫调节潜在的机制和靶标途径, 为黑鲷免疫增强剂的开发提供参考。

1 实验部分
1.1 仪器、试剂与材料

AB SCIEX ExionLC AD & TripleTOFTM5600+液相色谱-质谱联用系统(美国AB SCIEX公司); XS105分析天平(瑞士Mettler Toledo公司); ST-16R型高速冷冻离心机(美国Thermo公司); 氮吹仪(美国Organomation公司); 乙腈、甲醇、甲酸(均为色谱纯, 美国Sigma-Aldrich公司), 60 mg/L MS-222(3-aminobenzoic acid ethyl ester methanesulfonate, 色谱纯, 美国Sigma-Aldrich公司); 低聚氨基多糖(low molecular aminopolysaccharide, LA)相对分子质量约为50 kDa, 硒化氨基多糖为自制, 硒化低聚氨基多糖的硒含量为27.3 mg/g。

1.2 动物实验及样品处理

黑鲷幼鱼由浙江省海洋水产研究所试验场提供, 停饲1天, 挑选体质健康、大小均匀、初始体重为(13.00±0.20) g的黑鲷幼鱼随机分为2组, 每组3个重复, 每个重复25尾鱼, 放入容积为310 L(水体260 L)的玻璃纤维缸内微流水式饲养。饲喂普通饲料中添加0.6 mg Se/kg硒化氨基多糖的鱼为实验组, 饲喂不添加硒化多糖普通饲料的鱼为空白组, 实验周期为8周, 结束后将试验鱼饥饿24 h, 用60 mg/L MS-222麻醉, 取出肝脏组织, 实验组和空白组各随机抽取10个平行样, 称重后用液氮快速冷冻, 然后放于-80 ℃的超低温冰箱中保存, 备用。

1.3 样品前处理

取适当分量的样品于15 mL离心管中, 加入10倍体积的冰冷甲醇(-20 ℃冷冻)进行匀浆, 于4 ℃以13 000 r/min的速度离心15 min, 取5.0 mL上清液, 于40 ℃用氮气吹干, 用1.0 mL的甲醇-水(4:1, v/v)复溶, 待测。

在本试验中, 使用质控样品(quality control, QC)进行方法验证, 各取上述样品的上清液0.5 mL, 混合均匀, 于40 ℃用氮气吹干, 用1.0 mL的甲醇水(4:1, v/v)复溶得到。在样品的检测过程中, 每隔4个样品插入一个QC样品, 以监控检测系统的稳定性。

1.4 UPLC-Q-TOF-MS分析条件
1.4.1 侧重分析极性小的小分子代谢物的色谱条件

液相色谱:ExionLC AD; 色谱柱:Waters HSS T3柱(150 mm×2.1 mm, 2.5 μm), 为C18色谱柱; 柱温:40 ℃; 流速:0.3 mL/min; 进样盘温度:4 ℃; 进样量:2 μL。流动相A相:水(含2 mmol/L甲酸铵+0.05%(体积分数, 下同)甲酸); B相:乙腈-异丙醇溶液(1:1, v/v)。A相比例在1.0~5.0 min内由95%逐步降至30%, 5.0~14.0 min逐步降至10%, 14.0~16.0 min逐步降至0, 保持4 min, 20.1 min时A相变为95%, 维持5 min。

1.4.2 侧重分析极性大的小分子代谢物的色谱条件

液相色谱:ExionLC AD; 色谱柱:Acquity UPLC BEH Amide柱(100 mm×2.1 mm, 1.7 μm), 为HILIC(hydrophilic interaction liquid chromatography)色谱柱; 柱温:45 ℃; 流速:0.3 mL/min; 进样盘温度:4 ℃; 进样量:1 μL。流动相A相:水(含10 mmol/L甲酸铵+0.1%甲酸); B相:乙腈-水溶液(95:5, v/v; 含10 mmol/L甲酸铵+0.1%甲酸)。2.0~11.0 min内, A相比例由0逐渐升至55%, 保持1 min, 12.1 min时A相降至0, 维持5 min。

1.4.3 质谱条件

采用AB SCIEX TripleTOFTM 5600+液相色谱-质谱联用仪进行检测。采用电喷雾离子(ESI)源正、负离子扫描模式。喷雾电压(IS):正离子5 500 V, 负离子-4 500 V; 离子化温度:550 ℃; 雾化气压强:4.14×105 Pa; 辅助加热气压强:4.14×105 Pa; 气帘气压强:2.41×105 Pa。一级质谱采集范围:m/z 100~1 250, 累积时间:0.10 s; 去簇电压(DP): 80 V。采用数据关联采集(IDA)模式采集二级质谱, 采集范围:m/z 50~1 250;累积时间:0.050 00 s; DP: 80 V; 碰撞电压:(40±20) eV。IDA转换标准为:信号强度＞100 cps, 相对分子质量误差为50 mDa, 每个循环最多监测10个离子, 在4 Da内排除同位素。采用Analyst TF 1.7.1软件控制液相色谱-质谱联用分析系统, 并采集分析数据。

1.5 数据处理

利用XCMSplus[15]对采集的数据进行全面的非靶向代谢组学分析, 采用Centwave特征检测算法(峰值宽度从5到20 s, 质量允差为5 ppm(10-6, 下同))进行峰的发现和匹配, 找到有差异的化合物, XCMSPlus软件会自动链接到METLIN数据谱库(超过24万个代谢物信息, 其中12 127个代谢物有高分辨二级图谱), 并结合SCIEX公司独有的内源性代谢物二级谱库(包含550多个常见的内源性代谢化合物, 包括分子式、相对分子质量、CAS编号、化学名、结构图), 根据与谱库中化合物的精确一级m/z、同位素丰度比和二级质谱信息, 鉴定得出差异物, 并把这些差异物通过聚类分析, 找出差异通路。

2 结果与讨论
2.1 质谱分析

在快速分析实验中, 采用超高效液相分析系统可以获得较高的重现性和分离效果, 在处理肝脏等复杂基质时, 使用不同的色谱技术是实现检测特征最大化的关键问题。用于代谢组学实验的液相色谱条件, 包括所采用的溶剂和洗脱梯度并不是为了加强或针对任何特定代谢物的分离, 而应该具有广适性。本文采用了甲酸铵和甲酸为流动相的溶剂, 两种不同的色谱柱对肝脏样品进行了分析:C18色谱柱更好地分离了极性小的小分子代谢物, HILIC色谱柱对极性大的小分子代谢物分离效果最好, 并结合Q-TOF-MS/MS技术分别在正、负离子模式下对肝脏样本进行分离和数据采集, 实现了尽可能多地检测到小分子代谢物, 提高非靶向分析的准确性和正确性。飞行时间质谱仪对温度波动很敏感, 需要定期校准保障代谢组学实验数据的准确性。代谢物是根据测量的质量数来确定, 因此, 准确的质量测量对于代谢组学实验的成功至关重要。本实验使用的TripleTOFTM5600+系统采用外部校准方法, 测量的质量误差控制在5 ppm以内, 确保了采集数据过程中获得的数据准确有效。在IDA模式下, 在触发二级质谱(TOF-MS/MS)事件时, 需要监控TOF-MS/MS的最大数, 这会影响数据采集的信息量。虽然希望通过最大限度地增加TOF-MS/MS事件数来提高子离子的采集量, 但也要确保色谱峰有足够的采集数据点数。本试验采用的IDA方法为:扫描时间0.15 s和10个MS/MS事件, 每个事件的子离子累积时间为0.05 s, 循环时间为0.7 s, 可以实现每个色谱峰都具有10~12个采集数据点, 为质谱的统计评价和同时进行代谢物鉴定提供了高质量的一级质谱和二级质谱数据。图 1为各组样品典型的总离子流色谱图(total ion chromatograms, TIC)。由图 1可知, 空白组和添加硒化氨基多糖组的图谱存在一定的差异。在对分析数据进行预处理前, 首先对所获得的分析数据质量和有效性进行验证。数据有效性验证结果表明, QC样品中分布于不同保留时间的代表性离子色谱峰强度的RSD＜5%, 保留时间(RT)的漂移＜0.1 min, m/z波动范围不超过5 ppm。不同采集模式下QC样品的TIC图(n=8)见图 2。

图 1 不同采集模式下各组样品的总离子流色谱图 Fig. 1 Total ion chromatograms of each group of samples in different collection modes HILIC: hydrophilic interaction liquid chromatography.

图 2 不同采集模式下质控样品总离子流色谱图(n=8) Fig. 2 Total ion chromatograms of quality control (QC) samples in different collection modes (n=8)
2.2 肝脏PCA轮廓分析

对黑鲷肝脏代谢组学数据进行非靶向数据处理的目的是揭示最大和最具统计意义的变化。将饲喂硒化氨基多糖实验组和空白组的黑鲷肝脏正负离子代谢组学数据由XCMSplus SW软件分析质谱采集数据, 自动给出主成分轮廓分析(PCA)。正负离子模式下的黑鲷肝脏代谢物轮廓分析的PCA结果见图 3。从图中可以看出, 添加硒化氨基多糖组与空白组相比, HILIC柱和C18柱正负离子模式下的黑鲷肝脏代谢产物均发生了明显的变化。

图 3 不同采集模式下肝脏代谢物的PCA得分图 Fig. 3 Principal component analysis (PCA) scores for the hepatic metabolites in different collection modes Dmodx: distance to the model x.
2.3 潜在生物标志物的鉴定

潜在生物标志物的鉴定方法为通过一级质谱信息确定相对分子质量, 利用二级质谱信息获得其结构碎片信息。将用C18色谱柱和HILIC色谱柱在正、负离子模式下检测的质谱结果检索Metabolite HR MS2 library数据库(SCIEX), 共准确鉴定出32个有差异的生物标志物, 与空白组相比, 硒化氨基多糖添加组代谢生物标志物水平升高的有26种, 降低的有6种。具体结果见表 1。

表 1 非靶向代谢组学分析的差异代谢物 Table 1 Compound list obtained from untargeted approach and refining process
2.4 代谢途径分析

根据准确鉴定出的潜在生物标志物, 利用MetaboAnalyst3.0网站, 选用鱼为模型, 进行相关的代谢通路分析; 分析结果表明, 有显著性差异的32种潜在生物标志物主要指向了7条代谢通路(P＜0.05), 涵盖了氨基酰基-转运脱氧核糖核苷酸(tRNA)生物合成、氨基酸代谢、核苷酸代谢、氮代谢等, 具体见表 2。

表 2 通过MetPA分析得到的代谢通路 Table 2 Metabolic pathways by MetPA analysis

氨基酸是构成机体免疫系统的基本结构物质, 氨基酸与免疫系统的形成、器官发育以及功能的发挥有着密切的关系。经代谢通路分析, 发现硒化氨基多糖组与空白组相比, 在氨基酸合成或代谢、氨酰-tRNA生物合成、嘌呤代谢、氮代谢上存在比较显著的差异, 潜在生物标志物(见表 1)结果表明, 共有18个潜在生物标志物与11条氨基酸生物合成或代谢通路相关, 其中13个在给予硒化氨基多糖后浓度水平显著上调。在精氨酸和脯氨酸代谢通路中, 与空白组相比, 硒化氨基多糖组中精氨酸的含量呈下降趋势。精氨酸是鱼类的必需氨基酸之一, 精氨酸及其代谢产物一氧化氮(NO)、鸟氨酸和瓜氨酸可以通过生长激素等内分泌激素起到增强细胞吞噬和杀菌、促进免疫球蛋白的合成等免疫调节作用[16-18]。在机体中精氨酸主要通过2个代谢途径参与免疫调控[19, 20], 第一个代谢途径是精氨酸酶途径, 即精氨酸转化成鸟氨酸并进一步生成多胺, 鸟氨酸和多胺在动物的免疫调节中发挥着重要的作用; 另一条途径为精氨酸代谢成NO的途径, NO不仅对巨噬细胞发挥吞噬效应有重要作用, 还对巨噬细胞和淋巴细胞的连接和激活有影响, 有助于提高免疫细胞的呼吸爆发活性、吞噬作用和溶菌酶的活力[21, 22], 本实验中精氨酸含量的降低可能是由于硒化氨基多糖会调节使得精氨酸更多代谢成NO, 从而使机体的免疫调节增强, 这与石丹[23]的研究结果一致。

谷氨酰胺[24, 25]可以促进巨噬细胞和淋巴细胞的有丝分裂和分化增殖, 增加炎症因子的产生, 增加机体的免疫功能; 缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸等支链氨基酸能刺激单核细胞的增殖, 调节细胞因子的分泌, 增强免疫反应等。本试验中谷氨酰胺、苏氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸等在硒化氨基多糖组的含量均高于空白组, 表明给予硒化氨基多糖组的鱼中, 在氨基酸影响免疫调节上具有一定的增强作用。

3 结论

本研究采用UPLC-Q-TOF-MS技术对饲喂硒化氨基多糖的黑鲷肝脏进行了代谢组学研究。采用C18和HILLIC两种色谱柱结合XCMSplus软件进行分析, 共筛选出32个有差异的生物标志物, 经MetaboAnalyst3.0网站分析, 饲喂硒化氨基多糖对黑鲷的氨基酸合成或代谢、氨酰-tRNA生物合成、嘌呤代谢、氮代谢通路产生了影响, 硒化氨基多糖发挥免疫增强作用可能与氨基酸代谢具有较为密切的关系。本研究为深入探讨硒化氨基多糖的免疫增强机制奠定了一定的实验基础。

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