大环内酯类抗生素(macrolide antibiotics, MACs)是一类广谱性抗生素, 在临床以及养殖和畜牧业上均有广泛使用。但MACs的过量使用以及滥用, 使得细菌对其耐药性不断增加, 残留的抗生素会随着动物食品进入人体, 对人类健康造成威胁和隐患[1]。因此很多国家都对食品中的MACs设置了最大残留限量。如中国农业部第235号文件规定奶类中替米考星和泰乐菌素的最大残留限量均为50 μg/L[2]; 欧盟法规规定奶类中螺旋霉素和替米考星的最大残留限量分别为200 μg/L和50 μg/L[3]。目前针对MACs残留已经发展出了许多配套的分析方法如固相萃取[4]、液液萃取[5]、加速溶剂萃取结合液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)[6]等。固相萃取需要将吸附剂装填入一个萃取小柱, 萃取过程较为繁琐, 且无法适用于大体积样品处理; 液液萃取需要大量有机试剂; 质谱检测则存在使用和后期维护成本高昂, 较大基质效应干扰等问题。建立MACs分析方法, 有效的样品前处理是关键环节。
在众多的样品前处理技术中, 分子印迹聚合物(molecular imprint polymer, MIP)由于其高选择性而具有较大的优势。MIP是通过聚合反应在聚合物中形成一个与模板分子结构互补的空腔, 在萃取时只有与空腔结构匹配的分子才能被吸附, 可有效排除其他物质的干扰, 有利于提高萃取的选择性[7]。目前, MIP在分析化学、药物检测和生物传感器等方面都得到了广泛的应用[8, 9]。但是传统MIP存在空腔包埋太深和空间位阻等问题, 导致模板分子和MIP结合困难以及萃取后不易被洗脱。磁性表面分子印迹聚合物(magnetic surface molecularly imprint polymer, MS-MIP)可以在很大程度上克服上述问题[10]。
Song等[11]以泰乐菌素为模板, 甲基丙烯酸为功能单体制备出相应的MIP吸附剂, 之后使用LC-MS/MS对动物肌肉中的10种MACs进行了检测; Song等[12]通过沉淀聚合法制备了以托拉霉素为模板的MIP吸附剂, 结合LC-MS/MS实现了猪肉中7种MACs的同时测定。而目前有关用于MACs的MS-MIP吸附剂非常有限, 所能检索到的仅有Zhou等[13]以红霉素为模板, 制备出MS-MIP, 结合HPLC-UV应用于食品中多种MACs的检测。需要指出的是红霉素属于十四元MACs, 而使用最多的MACs类兽药是以泰乐菌素和替米考星为代表的十六元抗生素。目前以十六元MACs为模板的MS-MIP吸附剂尚无文献报道。
本论文以磁性纳米颗粒为基质, 制备了以替米考星为模板的MS-MIP吸附剂, 优化了合成与萃取步骤, 考察了吸附剂的性能并将其应用于奶粉中MACs残留的检测。
岛津LC-20A高效液相色谱仪(包括LC-20AD输液泵、DGU-20A3R在线脱气机、SIL-20AC自动进样器、SPD-20A检测器、LCsolution色谱工作站); 磁铁(55 mm×50 mm×25 mm); 氮吹仪(上海舜宇恒平科学仪器有限公司); 数显控温油浴锅(德国IKA公司); KH-100E超声波清洗器(宁波新芝生物科技有限公司); Milli-Q超纯水发生器(美国Millipore公司)。
替米考星(tilmicosin, TIL, 纯度99%)、螺旋霉素(spiramycin, SPI, 纯度97%)、交沙霉素(josamycin, JOS, 纯度91.2%)和泰乐菌素(tylosin tartrate, TYL, 纯度98.9%)均购自德国Dr. Ehrenstorfer公司; 磺胺嘧啶(sulfadiazine, 纯度99%)购自美国Alfa Aesar公司; 恩诺沙星(enrofloxacin, 纯度99%)和盐酸土霉素(oxytetracycline hydrochloride, 纯度99%)购自美国Sigma-Aldrich公司; 纳米Fe3O4(99.5%, 约20 nm)购自阿达马斯试剂有限公司; 二甲亚砜(DMSO)购自上海麦克林生物科技有限公司; 甲基丙烯酸(MAA)和3-(甲基丙烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷(MPS)购自上海阿拉丁化学试剂有限公司; 甲醇和乙腈(均为色谱纯)购自美国Tedia公司; 以上试剂除特殊指明外均为分析纯试剂。
称取1.0 g纳米Fe3O4于三口烧瓶中, 加入100 mL去离子水超声使其分散均匀。缓慢滴加25 mL 1.0 mol/L的九水硅酸钠溶液, 边滴加边搅拌, 滴加完成后用4 mol/L盐酸调节溶液pH至6.0左右, 然后80 ℃反应3 h。反应结束后, 依次用甲醇和纯水清洗产物3遍, 最后冷冻干燥得到Fe3O4@SiO2。
取0.5 g干燥后的Fe3O4@SiO2于圆底烧瓶中, 加入0.6 mL MPS, 40 mL无水甲苯和0.5 mL吡啶, 在N2保护下115 ℃、800 r/min反应24 h。反应结束后依次用甲苯、甲醇洗至无色, 干燥后得到Fe3O4@SiO2-MPS。
称取208.6 mg替米考星和250 μL甲基丙烯酸于圆底烧瓶中, 加入40 mL二甲亚砜, 于30 ℃、500 r/min条件下预聚合1 h。然后依次加入300 mg Fe3O4@SiO2-MPS, 55 mg偶氮二异丁腈和120 mg聚乙烯吡咯烷酮。N2保护下60 ℃、800 r/min反应24 h。得到的产物用纯水和甲醇清洗3遍, 60 ℃下干燥12 h后得到MS-MIP吸附剂(其合成路线图见图 1)。
非分子印迹聚合物(MS-NIP)制备方法同上述MS-MIP, 区别是不使用模板分子。
使用30 mL甲醇-乙酸(80:20, v/v)溶液, 超声30 min去除模板分子, 经测定重复洗脱4次可以完全去除模板分子。
称取10 mg MS-MIP吸附剂于锥形瓶中, 加入2 mL甲醇超声活化, 再加入20 mL 0.5 mg/L的标准溶液, 超声3 min后静置30 min, 在外加磁场下倒去溶液, 加入4 mL乙腈-乙酸(80:20, v/v)溶液进行洗脱, 收集洗脱液吹干, 最后加入1 mL甲醇重溶并注入HPLC-UV系统检测。
色谱柱为XCharge C18(150 mm×4.6 mm, 3.5 μm, 华谱新创科技有限公司), 柱温25 ℃; 流动相A为0.02%(v/v)磷酸水溶液, B为甲醇, 高压梯度洗脱模式:0~10 min, 10%B~90%B; 10~20 min, 90%B; 20~22 min, 90%B~10%B; 22~32 min, 10%B。进样体积20 μL, 流速1.0 mL/min, 检测波长分别为232 nm和282 nm。
考察吸附剂的饱和吸附量, 选择质量浓度分别为0.5、2、5、10、15、20、25 mg/L的7个替米考星标准溶液为样品溶液, 按照1.3节中步骤进行萃取。根据公式(1)[14]计算不同浓度下MS-MIP和MS-NIP的吸附量Qe。
式中, Qe(mg/g)为不同浓度下吸附剂的吸附量, Ce(mg/L)为TIL经氮吹重溶后的质量浓度, V(L)为重溶体积, M(g)为吸附剂质量。
考察吸附剂的吸附平衡时间, 萃取过程遵循1.3节内容, 但设置标准溶液质量浓度为1.0 mg/L, 改变超声后的静置时间为3、15、30、50、70 min, 根据公式(2)[14]计算相应时间下的吸附量。
式中, Qt(mg/g)为不同静置时间下吸附剂的吸附量, Ct(mg/L)为TIL经氮吹重溶后的质量浓度, V(L)为重溶体积, M(g)为吸附剂用量。
在3种不同条件下考察吸附剂的富集能力, 分别为:将1 mL 0.5 mg/L的标准溶液直接过膜然后注入液相色谱检测; 用MS-MIP和MS-NIP吸附剂分别对60 mL 0.05 mg/L的标准溶液进行萃取, 最后甲醇重溶至200 μL, 然后用液相色谱检测。
MS-MIP对目标分子的富集因子通过公式(3)计算[15]:
式中, C0和C1分别为标准溶液直接进样的质量浓度及富集前样品溶液的质量浓度; A0和A1分别为直接进样得到的峰面积及富集后的峰面积大小。
奶粉样品均购自本地超市。称取3 g奶粉加入15 mL乙腈, 超声15 min后以10 000 r/min离心15 min, 收集上清液旋蒸至干, 纯水重溶至15 mL后备用。
模板分子、功能单体和交联剂三者之间的比例不同, 会导致制得的聚合物在萃取能力上存在差异; 另一方面, 反应溶剂在分子印迹聚合物制备过程中又作为致孔剂, 可以促进印迹空腔的形成, 所以其种类选择非常重要。实验中以20 mL 0.5 mg/L的替米考星标准溶液作为样品溶液, 萃取过程如1.3中所述。经过优化, 当替米考星与甲基丙烯酸的摩尔比为1:12时, 吸附剂对替米考星的萃取效果最佳(见图 2a); 考察了3种常见溶剂乙醇、乙腈和DMSO, 结果表明DMSO为反应溶剂时, 所得吸附剂萃取效果最佳(见图 2b)。
考虑到MACs具有弱碱性, 溶液pH值改变会影响它在水中的电离程度和稳定性, 因此考察了样品pH值和洗脱剂用量对4种MACs萃取效果的影响。如图 3a所示, 样品溶液的pH值对4种目标MACs的萃取效果不尽一致, 对替米考星而言, pH为7时萃取效果最佳; 对螺旋霉素和交沙霉素来说, pH=8.5时萃取效果最好; 泰乐菌素在这两个pH值下的萃取效果几乎没有差异。综合考虑, 最终选择中性条件为萃取条件。选择乙腈-乙酸(80:20, v/v)溶液为洗脱剂, 考察其用量对萃取的影响, 结果表明在4 mL以后萃取效果不再有明显变化(如图 3b), 说明该用量足以将MACs完全洗脱, 所以后续以4 mL为最终洗脱体积。
替米考星标准溶液初始浓度与吸附量的关系如图 4a所示, 随着浓度的增加, MS-MIP对替米考星的吸附量不断增加, 但在20 mg/L以后, 样品溶液的初始浓度继续增加, 吸附量没有显著变化, 此时的饱和吸附量QMS-MIP根据公式(1)计算得22.80 mg/g, 相比之下QMS-NIP仅为10.80 mg/g。这可能是因为MS-MIP中有与替米考星结构匹配的印迹空腔, 使得萃取时吸附剂和替米考星更易结合, 而MS-NIP的结构不规则, 无法特异性识别替米考星分子。
MS-MIP与MS-NIP的吸附平衡考察如图 4b所示, 可以看出, MS-NIP在15 min左右基本可以达到吸附平衡, 而MS-MIP达到吸附平衡需要30 min左右。MS-NIP较快的吸附平衡可能是由于其吸附能力比较弱所致。为考察MS-MIP吸附平衡时间的优劣, 与文献报道的其他MIP的吸附平衡时间做了对比(见表 1)，可以看出，相比其他类似的以抗生素为模板分子制备的MS-MIP以及传统MIP, 本工作制备的MS-MIP吸附平衡用时是可以接受的。
选取和替米考星结构类似的其他3种大环内酯类抗生素:螺旋霉素、交沙霉素和泰乐菌素, 以及与替米考星结构不同的其他3类抗生素:喹诺酮类恩诺沙星、磺胺类磺胺嘧啶和四环素类盐酸土霉素, 在相同条件下进行萃取, 结果见图 5, 可以看出, MS-MIP对4种MACs均具有明显的萃取效果, 但对3种非MACs类抗生素萃取作用很弱; 相比之下, MS-NIP没有明显选择性, 对MACs的萃取效果明显弱于MS-MIP, 相反对磺胺嘧啶, 恩诺沙星和盐酸土霉素的萃取能力优于MS-MIP。这也证明了MS-MIP对替米考星及其结构类似物具有较好的选择性。
是否具有良好的富集效果是评判吸附剂的一个重要性能指标。为考察MS-MIP的富集效果, 与直接进样进行了对比, 结果见图 6。MS-MIP对SPI、JOS、TIL、TYL的富集倍数经1.6节中公式(3)计算分别为212、275、675、293倍; 使用MS-NIP萃取时, 上述4种目标物的富集倍数分别为99、73、205、69倍。这显示出MS-MIP对MACs具有较好的富集浓缩能力。
称取10 mg吸附剂, 在以水为基质的样品溶液中按照相同的萃取条件反复萃取6次, 发现每次的萃取结果差异很小(RSD＜7.82%), 说明吸附剂具有良好的重复利用性, 可以至少循环使用6次。
在经预先检测不含MACs或含量在检出限以下的奶粉样品中添加4种MACs标准品80~800 μg/kg, 按优化后的萃取参数进行萃取, 每个浓度平行实验3次, 绘制基质添加标准曲线(y为4种MACs的峰面积, x为对应的含量), 结果如表 2所示, 在该范围内线性关系良好, R2＞0.99。按3倍和10倍信噪比计算检出限和定量限分别为0.58~1.36 μg/kg和1.92~4.55 μg/kg。
在空白奶粉中分别添加80、200、500 μg/kg的4种MACs混合标准品, 进行方法回收率和精密度考察, 日内每个浓度平行实验5次, 日间为连续3天, 结果见表 3所示, 4种MACs的日内和日间回收率和精密度均良好, 日内回收率为83.2%~123.0%, 精密度为1.6%~10.2%;日间回收率为83.9%~121.0%, 精密度为1.4%~12.2%。
由图 7可看出, 200 μg/kg加标水平的奶粉经过MS-MIP富集后检测得到的色谱图中, 4种抗生素的色谱峰都非常明显, 但相比2.4节中的富集效果图, 这里交沙霉素的峰最高, 替米考星次之, 可能是因为基质不同的原因, 前期实验是在水溶液中进行, 而奶粉基质更加复杂, 干扰物更多, 对奶粉的前处理可能会造成部分抗生素的损失; 600 μg/kg加标水平的奶粉经简单处理后直接用液相色谱检测得到的色谱图中, 4种抗生素中只有交沙霉素和泰乐菌素略有响应, 螺旋霉素和替米考星未检测到; 空白奶粉经MS-MIP萃取后的液相色谱图中, 4种MACs均未检出, 证明本吸附剂可以用于对奶粉中痕量MACs的有效前处理。
本文报道了一种以替米考星为模板分子的磁性表面分子印迹聚合物吸附剂。该吸附剂对4种十六元的MACs具有良好的选择性和富集能力, 且吸附平衡时间较短, 可以结合HPLC-UV应用于奶粉中MACs残留的检测, 有望应用于其他类型样品中抗生素痕量残留的前处理。
2019,
Vol. 37 Issue (9): 932-938 DOI: 10.3724/SP.J.1123.2019.03005 
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