随着生活水平的提高, 我国乳制品消费需求与日俱增, 中国奶业协会发布的首份《中国奶业质量报告》显示, 2015年我国人均乳制品折合生鲜乳消费量36 kg, 约为世界平均水平的1/3。由于消费需求剧增, 液态奶的进口贸易量也与日俱增, 据海关统计, 2015年1月至11月, 液体乳进口58.23万吨, 货值5.89亿美元, 同比分别增长46.48%和37.79%[1, 2]。但多数的进口液态奶无法实现源头监管, 只能通过对终产品的监测来保证其品质, 2017年中国农业科学院奶产品质量与风险评估创新团队发布了《中国奶产品质量安全研究报告》。该报告显示, 进口超高温瞬时灭菌(UHT)奶的糠氨酸含量显著高于国产UHT奶, 并存在加热过度和添加了复原乳的问题[3]。其中, 糠氨酸就是乳制品加工过程中反映工艺条件的标志物, 本文概述了目前国内外乳制品加工过程中反映工艺条件标志物的研究概况, 以期为完善我国相关标准和制度提供一定的理论基础。
自20世纪90年代以来, 欧盟乳制品化学专家组和国际乳品联合会(IDF)提议通过研究乳品加工过程中化学标志物的变化来评估乳品的品质[4]。在乳制品热处理工艺控制领域中, 也是采用监测乳品中某种标志物的方法来控制乳品的质量。近些年, 比利时、法国、西班牙和瑞士等国采用监测标志物含量的方法对UHT奶进行质量调查。糠氨酸作为美拉德反应的产物, 其含量可以很好地体现美拉德反应程度, 很多国际组织用糠氨酸含量来评价热处理过程中牛奶的加热程度。1992年, 欧盟各国政府首次将糠氨酸的质量分数作为鉴定液态乳品质的一个重要指标, 1996年国际奶业联合会正式公布糠氨酸的检测方法[5]。2005年, 我国农业部颁布了NY/T 939-2005《巴氏杀菌乳和UHT灭菌乳中复原乳的鉴定》, 首次将美拉德反应产物糠氨酸和乳果糖作为鉴定复原乳的标志物[6]。
近些年采用时间温度标志物来监控乳制品质量的方法逐渐成为研究的热点, 方法通常包括两种标志物:一种是热不稳定物质, 降解物、变性物和钝化物, 例如乳清蛋白或酶等物质; 一种是未经加工处理的牛奶中不存在的新物质成分, 或仅痕量存在的物质, 如乳果糖或美拉德反应产生的其他物质。但方法影响因素太多, 例如加工方式、pH值、储存条件等多种因素, 因此通常都是同时测定几种标志物确定工艺条件。
Cattaneo等[7, 8]对UHT奶和奶粉中乳果糖、糠氨酸、半乳糖基-β-吡喃酮和赖丙氨酸中的含量进行了研究, 所有标志物的含量均能随循环奶比例的增加而不同程度的增加, 其中这4种标志物中赖丙氨酸是反应储存条件最灵敏的标志物。Pereda等[9]通过对羟甲基糠醛、自由巯基、糠氨酸、乳果糖和乳清蛋白变性标志物的研究, 对超高压均质奶的热损失进行了评估。
赖丙氨酸(lysinoalanine, LAL)作为晚期糖基化终产物的一种, 其结构式见图 1。1964年, Bohak在经碱处理后的牛胰脏核糖核酸A中发现了LAL[10]。同年, Ziegler和Pathchornik分别在碱处理的羊毛和脱氧核糖核蛋白-核糖核酸酶(DNP-RnaseA)中发现了LAL[11]。富含蛋白质的食品或食品原料在高温或碱处理时易产生赖丙氨酸。赖丙氨酸的产生伴随着食品中必需氨基酸的减少和外消旋化, 使含蛋白质的食品营养价值降低。随着研究的深入, 发现赖丙氨酸的形成有很多因素, 包括食品组分、食品加工方式、食品储存条件等。同时在很多食品种类中测出了赖丙氨酸, Faist等[12]采用高效液相色谱法(LC)测定含有乳蛋白的食品, 发现赖丙氨酸是一种能够评估牛奶在加热过程中是否掺假的灵敏标志物。Calabrese等[13]采用液相色谱-质谱法对乳制品中赖丙氨酸进行测定, 发现在原乳中并未检测到赖丙氨酸, 但在加工产品奶粉中均检测到高含量的赖丙氨酸。
20世纪70~80年代, 国外学者开始致力于LAL检测方法的研究, 如薄层层析法(TLC)、氨基酸分析仪法和酯化酰化两步衍生化的气相色谱法以及液相色谱法等。Bosch等[14]对婴幼儿谷物食品进行分析，用6 mol/L盐酸在110 ℃下水解24 h, 用硅烷化试剂N-(特丁基二甲基硅烷基)-N-甲基三氟乙酰胺(MTBSTFA)与赖丙氨酸进行衍生, 形成N-叔丁基二甲基甲硅烷基(tBDMSi)衍生化合物, 之后采用GC-FID定量, GC-MS定性。
糠氨酸(furosine)是美拉德反应的产物, 其化学结构式见图 2。近年来, 糠氨酸常被用作判断食品受热程度的指标, 在谷物、蛋类、肉制品、乳制品中均有应用[15]。1992年欧盟各国政府将糠氨酸含量作为判断液态奶成品质量优劣的一个重要指标, 其检测方法于1996年被IDF正式确认; 欧盟和国际乳品联合会分别于1996年和1998年提出以糠氨酸和乳果糖作为衡量复原乳的标志物[16]。蛋白质暴露的赖氨酸与乳中游离乳糖发生反应, 经过酸水解最终形成游离的糠氨酸。加热温度和时间是影响牛奶中糠氨酸含量的两个重要因素, 在牛奶储存过程中糠氨酸含量也会发生变化, 另外蛋白质的含量和种类、糖的含量、pH值及金属离子都能影响糠氨酸的含量。
1990年, Resmini等[17]首次建立了高效液相色谱检测牛奶中糠氨酸含量的测定方法。随着检测技术的不断发展, 目前糠氨酸的检测方法包括高效液相色谱法、高效液相色谱-串联质谱法、毛细管色谱-串联质谱法等[18]。
乳果糖(lactulose)又名4-O-β-D-吡喃半乳糖基-D-果糖, 是由半乳糖与果糖组成的二糖, 在自然界中并不存在, 其化学结构见图 3。20世纪50年代首次发现在牛奶加热过程中, 在酪蛋白游离氨基酸基团催化条件下, 乳糖的碱基发生异构化生成一种合成双糖——乳果糖[19]。乳果糖是乳糖在牛奶热处理过程中发生碱基异构的产物, 源自果糖的异构化分子, 是评估奶热处理程度的标志物。Schlimme等[20]指出乳果糖含量为100~400 mg/L和酸性可溶β-乳球蛋白高于50 mg/L可作为UHT奶的阈值参数。Corzo等[21]建议用糠氨酸的含量、早期美拉德反应的程度以及乳果糖的含量来表征灭菌乳的真实性和质量。
目前, 乳果糖的测定方法主要有生物传感器法、气相色谱法、安培电流计法、离子交换色谱法、噻唑蓝(MTT)显色法、微分pH计法, 以及普及性和稳定性较强的酶解法、高效液相色谱法和更加简单、快捷及成本较低的弥漫反射傅里叶变换红外光谱学检测法等[22-24]。
半乳糖基-β-吡喃酮(galactosyl-β-pyranone, GAP)是乳制品中乳糖通过美拉德反应形成1-脱氧邻酮醛后，继而产生的两种糖基化产物之一。Cattaneo等[25]在饮用UHT奶中测出了半乳糖基-β-吡喃酮, 研究表明, 90%的半乳糖基-β-吡喃酮是超高温灭菌过程本身造成的, 它被证明是一种能够区分是否过热、循环奶滥用、过期饮用奶循环利用的非常灵敏的标志物。
目前, 有关半乳糖基-β-吡喃酮测定方法的研究较少, Pellegrino等[26]提出用于评价GAP的无干扰高效液相色谱法, 其前处理方法选用固相萃取法。
羟甲基糠醛(5-hydroxymethylfurfural, HMF)又名5-羟甲基-2-呋喃甲醛, 其结构式见图 4, 主要由美拉德反应和己糖酸性条件下脱水产生。在美拉德反应的结束阶段, 脱氧邻酮醛糖类中间产物进一步反应, 在pH＜7条件下, 可生成5-羟甲基糠醛。5-羟甲基糠醛会改变牛乳的原有风味, 使产品的接受程度降低[27]。5-羟甲基糠醛经过胺化反应, 最终形成褐色的化合物, 成为类黑精。食用过多的5-羟甲基糠醛可能会导致基因突变和引起DNA链断裂, 具有潜在的致癌风险[28], 欧盟食品安全委员会认为, 每人每天摄入HMF的上限为1.6 mg[29]。
牛奶中的5-羟甲基糠醛通常包括紫外分光光度法、衍生化分光光度法、液相色谱法、气相色谱-质谱法[30, 31]。高萌[32]采用高效液相色谱法测定不同加工条件下羟甲基糠醛的含量变化, 采用草酸进行水解, 然后采用三氯乙酸进行蛋白质沉淀净化基质。万博恺等[33]利用顶空固相微萃取-气相色谱-质谱法在5种市售酱油中鉴定出糠醛、2-乙基-1-己醇和5-甲基糠醛3种羟甲基糠醛衍生物。对酱油直接进行SPME萃取分析后发现其加标回收率不符合国标要求, 最终选用蒸馏水将酱油稀释5倍。
巯基是由一个硫原子和氢原子连接组成的一阶原子团, 结构式为-SH。在乳品的氨基酸成分中, 半胱氨酸和蛋氨酸是含硫的氨基酸, 其中半胱氨酸残基中的巯基是所有蛋白质氨基酸残基中最活泼的基团。在加热过程中, 氨基酸会发生一系列反应, 半胱氨酸和蛋氨酸中的含硫组分也会发生变化, 影响巯基的含量, 造成乳制品风味物质的变化。宋慧敏[34]研究了热处理对牛乳中巯基含量的影响, 实验结果表明, 随着加热温度和时间的增加, 巯基含量整体呈下降趋势。在加热温度偏低和时间较短的情况下, 巯基的含量相对更高, 这是由于加热后巯基具有了活性, 产生了硫化物和硫化氢, 这些硫化物对牛乳的风味影响较大, 尤其是产生了令人不愉快的蒸煮味, 这也是UHT乳比巴氏杀菌乳口感差的原因。
自由巯基的检测方法主要有电化学和比色法[35]。林慧珏等[36]对几种以比色法为原理的麦粉中自由巯基的测定方法进行了对比研究, 发现环境pH值为6.5, 缓冲液为以下4种成分3 mol/L尿素、0.001 mol/L乙二胺四乙酸(EDTA)、2%(质量分数)十二烷基硫酸钠(SDS)、0.05 mol/L磷酸钠时, 是提取小麦粉中巯基的最佳条件。
碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)不耐热, 最适的pH值为7.6~7.8, 在63 ℃杀菌30 min, 或在71~75 ℃杀菌15~30 s可钝化。碱性磷酸酶在牛乳中比较重要, 其含量因乳牛个体、泌乳期以及乳牛疾病等条件不同而异。Scharer磷酸酶试验表明, 利用碱性磷酸酶作为标志物, 即使在巴氏杀菌乳中混入0.5%(v/v)的原料乳亦能被检出[37]。欧盟法规EC No 853/2 004规定巴氏杀菌乳的加工条件为:高温短时热处理(至少72 ℃, 15 s)或低温长时热处理(至少63 ℃, 30 min)或任何能达到同等效果的其他温度和时间的组合经碱性磷酸酶测试后应呈阴性[38]。因此碱性磷酸酶可以用来检验低温巴氏杀菌法处理的消毒乳的杀菌程度是否完全。
对于碱性磷酸酶的测定, Vega-Warner等[39]用制备的多克隆抗体采用酶联免疫吸附测定方法进行测定。我国《生鲜牛乳及其制品中碱性磷酸酶活度的测定方法》采用的是分光光度计法测定碱性磷酸酶[40]。
乳过氧化物酶(lactoperoxidase)是存在于乳汁中的一种血红素蛋白, 是牛乳中常见的成分之一, 它可以钝化一些有活性、具有同化作用的细菌酶, 阻止细菌的新陈代谢作用及增殖能力, 达到抑制或杀灭细菌的目的, 从而延长生牛乳的保质期[41]，同时对牛乳特有的嗜冷菌有抑制作用。乳过氧化物酶有较强的抑菌作用, 在75~80 ℃失活, 比碱性磷酸酶更具有热稳定性, 可以通过测定乳过氧化物酶的活性间接了解乳制品的热处理情况。在加热温度为85~90 ℃时, 芽孢杆菌会热休克形成孢子, 影响乳制品的品质。因此乳过氧化物酶的活性可以用来评估巴氏杀菌乳热处理情况。[42]。
目前, 国内外有关乳过氧化物酶检测方法的研究较多, 大多是基于颜色反应, 利用酶促反应原理, 借助分光光度计测定酶活大小。常用的显色剂有2, 2′-连氮基-双(3-乙基苯并噻吡咯啉-6-磺酸)二氨盐(ABTS)、3, 3′, 5, 5′-四甲基联苯胺(TMB)、愈创木酚、苯胺及邻苯二胺等[43]。以苯胺类检测乳过氧化物酶(LP)活性的方法虽然成本低, 但是操作繁琐, 误差较大, 同时苯胺类物质具有致癌性, 导致其被新的显色物质所取代。TMB因其安全性和较高的敏感性, 目前应用越来越广泛。谢莉等[44]利用酶促反应原理, 用2 mL无水乙醇溶解20 mg四甲基联苯胺后, 用柠檬酸缓冲液定容至100 mL, 最后加入1 mg/mL辣根过氧化物酶(HRP)1 mL, 混合均匀后制成显色剂。方法以定量滤纸为载体, 制成用于快速检测过氧化氢的试纸条。该试纸条能够在10 s内对牛奶中的过氧化氢残留进行半定量检测, 最低检出限达到0.5 mg/L, 并且操作简单, 价格低廉, 十分适用于奶制品厂和基层奶站的现场检测。
乳清蛋白(whey protein)是指溶解分散在乳清中的蛋白质, 乳清蛋白也是乳制品中对热最为敏感的蛋白质, 即使在相对较低的温度下, 也易发生变性。乳清蛋白主要由β-乳球蛋白(占乳清蛋白的50%, 下同)、α-乳白蛋白(25%)和牛血清白蛋白(6%)组成[45]。在乳品热加工过程中, 当温度超过了蛋白质的耐受温度, 其结构、生物活性和溶解度都发生了变化, 即蛋白质热变性。由于可溶性乳清蛋白质的质量分数与热处理的强度成反比, 因此, 可以根据可溶性乳清蛋白质的质量分数来评估乳制品的热处理强度[46]。研究发现, 热加工的温度和时间是影响乳清蛋白变性的重要因素, 当热加工条件为77.5 ℃加热60 min或90 ℃加热5 min时, 乳清蛋白会彻底变性, 巴氏杀菌乳清蛋白变性率达10%~20%, 直接UHT乳的乳清蛋白变性率达40%~60%, 间接UHT乳的乳清蛋白变性率达70%~90%[47, 48]。Sakkas等[49]对生乳进行直接加热, 在120 ℃、30 s, 130 ℃、20 s, 140 ℃、15 s条件下, 90%的β-乳球蛋白发生变性; 在120 ℃、80 s, 130 ℃、40 s, 140 ℃、30 s条件下, 99%的β-乳球蛋白发生变性。因此, 在实际应用中β-乳球蛋白可以作为乳品热加工程度的标志物。IDF也对乳制品中的β-乳球蛋白提出限量要求, 巴氏杀菌乳中β-乳球蛋白的最低限量为2 600 mg/L, 高温巴氏杀菌乳的最低限量为2 000 mg/L[50]。
董学艳等[51]以凯氏定氮法为标准, 对比了二喹啉甲酸法、福林-酚试剂法和考马斯蓝染色法3种方法对母乳中乳清蛋白含量的测定结果。实验结果表明, 福林-酚试剂法的检测结果与凯氏定氮法的结果最相似, 适于母乳中乳清蛋白的测定, 并且该方法只需要4 mL母乳样本, 即可在1.5 h内完成母乳中乳清蛋白的高通量快速检测。杨怀荣等[52]采用高效液相色谱法测定猪乳中乳清蛋白含量, XbridgeTMSneild RP C18色谱柱用于α-乳白蛋白、β-乳球蛋白和溶菌酶的分离检测, Supelcosil C18色谱柱用于乳铁蛋白和血清白蛋白的分离检测。α-乳白蛋白、β-乳球蛋白、血清白蛋白、溶菌酶和乳铁蛋白的检出限分别为0.6、1.0、0.3、0.2和4.0 mg/L。
液态奶在加工过程中有两种标志物，第一种是热不稳定物质，例如碱性磷酸酶、乳过氧化物酶、乳清蛋白等。第二类是未经加工处理的牛奶中不存在的新物质成分，或仅痕量存在的物质，包括赖丙氨酸、糠氨酸、乳果糖、半乳糖基-β-吡喃酮、5-羟甲基糠醛和自由巯基等。这类物质由于其稳定性较好，已经成为国内外的研究热点。本文简述了以上九种乳制品加工过程中标志物的国内外研究概况，以期为完善我国乳制品加工过程中的监管制度提供理论依据，保障消费者权益。
2019,
Vol. 37 Issue (10): 1084-1089 DOI: 10.3724/SP.J.1123.2019.03010 
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2019,
Vol. 37 Issue (10): 1084-1089 DOI: 10.3724/SP.J.1123.2019.03010 PDF