超高效液相色谱-串联质谱法快速测定六神曲中的米酵菌酸


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	王俊虎

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王俊虎^#, 乔勇升^#, 王建, 朱渊

泰州市食品药品检验所, 江苏泰州 225300

收稿日期：2019-03-12

基金项目：江苏省食品药品监督管理局科研项目(20170227);泰州市科技支撑计划社会发展项目(TS201812)

通讯联系人：朱渊, E-mail:dreamzy215@sina.com

#共同第一作者

摘要：基于超高效液相色谱-串联质谱法（UPLC-MS/MS），建立了快速测定六神曲中生物毒素米酵菌酸残留的检测方法。样品首先以甲醇作为提取溶剂进行超声提取，再用氨水调节pH值至8，过滤，滤液用Oasis MAX强阴离子交换固相萃取柱处理。采用Waters HSS T3色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）分离，以乙腈-含0.1%（体积分数）甲酸的10 mmoL/L甲酸铵溶液为流动相，采用电喷雾电离（ESI）源电离，电离模式为负离子模式，质谱检测模式为多反应监测（MRM）模式。在最佳条件下，米酵菌酸在0.5~100 μg/L范围内呈良好的线性关系，相关系数（R²）>0.99。方法的加标回收率为80.6%~85.3%，日内和日间精密度分别为4.2%~6.8%和8.2%~13.2%。方法的检出限（LOD，S/N=3）和定量限（LOQ，S/N=10）分别为0.4 μg/kg和1.2 μg/kg。实际样品测定中发现了六神曲中存在米酵菌酸残留的现象，为保健食品和中药材中生物毒素的风险监控提供了重要的科技支撑。该方法简单、快速、灵敏度高，适用于六神曲中生物毒素米酵菌酸残留量的测定。

关键词：超高效液相色谱-串联质谱生物毒素米酵菌酸六神曲

Rapid determination of bongkrekic acid in Liushenqu by ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry

WANG Junhu^#, QIAO Yongsheng^#, WANG Jian, ZHU Yuan

Taizhou Institute for Food and Drug Control, Taizhou 225300, China

Foundation item: Scientific Research Project of Food and Drug Administration of Jiangsu Province of China (No. 20170227); Taizhou Science and Technology Support Program Social Development Project of China (No. TS201812)

Abstract: A method for the rapid determination of biotoxin (bongkrekic acid) in the Liushenqu was established using ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (UPLC-MS/MS). The samples were extracted with methanol by ultrasonication, then the pH was adjusted to 8 using ammonia. After filtration, the extract was purified using an Oasis Max strong anion exchange resin column. The Waters HSS T3 column (100 mm×2.1 mm, 1.8 μm) was used for the UPLC-MS/MS analysis. The mobile phase was acetonitrile-10 mmol/L ammonium formate solution (containing 0.1% (v/v) formic acid). MS analysis was performed using an electrospray ionization (ESI) source in the negative and multiple reaction monitoring (MRM) modes. Under the optimum conditions, the linear range of bongkrekic acid was 0.5-100 μg/L (correlations coefficient (R²)>0.99). The recoveries of the bongkrekic acid were 80.6%-85.3%. The intra-day and inter-day relative standard deviations (RSDs) were in the range of 4.2%-6.8% and 8.2%-13.2%, respectively. The limit of detection (LOD) and limit of quantification (LOQ) were 0.4 μg/kg and 1.2 μg/kg, respectively. The results showed that bongkrekic acid residues were detected in Liushenqu, thereby confirming the supporting role of our method for the risk monitoring of biotoxins in health foods and Chinese herbal medicines. This method is simple, easy, sensitive, and suitable for the determination of the bongkrekic acid residues in Liushenqu.

Key words: ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (UPLC-MS/MS) biotoxin bongkrekic acid Liushenqu

六神曲又名神曲、六曲, 始载于唐《药性论》, 为复方天然发酵曲剂^{[1, 2]}, 由苦杏仁、青蒿、苍耳草、辣蓼、赤小豆按照一定的比例混合, 再加入面粉和麦麸后经发酵而成^[3]。六神曲的主要功效为健脾和胃、消食调中, 为中医临床上最常用的消食药物之一, 主要含有酶类、挥发油、麦焦甾醇、酵母菌等, 临床疗效确切^[4]。因六神曲采用传统工艺经发酵制成, 所以在发酵过程中可能会引入杂菌, 王秋红等^[5]对六神曲发酵微生物进行分离和鉴定, 确定其含有黄曲霉菌等3种真菌, 另有文献[6]报道在六神曲中检测到生物毒素黄曲霉毒素和杂色曲霉素, 而关于六神曲中米酵菌酸(bongkrekic acid)残留的研究鲜有报道。

米酵菌酸是由椰毒假单胞菌米面亚种产生的一种脂肪酸代谢产物, 它最早由荷兰学者于20世纪30年代在研究食物中毒时发现^[7], 米酵菌酸的分子式为C₂₈H₃₈O₇, 相对分子质量为486.6^[8]。研究表明, 米酵菌酸会抑制线粒体腺嘌呤核苷酸转移酶(ANT)的活性, 从而抑制线粒体中ATP的合成, 导致细胞凋亡、损伤^{[9, 10]}。食用含有米酵菌酸的食物会引起肝脏、脑部和肾脏细胞损伤, 严重的甚至会导致人体死亡^[11]。发酵米面制品、变质银耳和发酵的椰子及其制品容易被椰毒假单胞菌污染, 产生米酵菌酸, 误食含有米酵菌酸的食物很容易导致食物中毒^{[12, 13]}。2015年在莫桑比克一个村庄的婚礼上爆发了群体性食物中毒事件, 事件导致75人死亡, 177人住院, 有关机构在婚礼上的一种椰子制品食物中发现了相当含量的米酵菌酸^[12]。2014年云南省文山县发生了一起因食用自制吊浆粑汤圆而导致的食物中毒事件, 事件共造成6人死亡, 事后调查发现该食物中毒事件是由椰毒假单胞菌亚种唐菖蒲伯克霍尔德菌污染吊浆粑产生大量米酵菌酸所致^[14]。

目前米酵菌酸的检测方法主要有薄层色谱法、紫外分光光度法、液相色谱法和液相色谱-串联质谱法^{[15, 16]}。其中薄层色谱法步骤复杂, 灵敏度低, 不适合大批量样品的检测; 紫外分光光度法专属性差, 灵敏度低; 液相色谱法分析时间长, 灵敏度较低; 超高效液相色谱-串联质谱法前处理简单, 分析时间短, 专属性好, 灵敏度高, 适合大批量样品的快速检测。当前文献^[12-16]关于米酵菌酸的检测多集中在食品中, 比如发酵米面制品和银耳等, 并没有相关文献介绍中药六神曲中米酵菌酸的检测方法, 更没有文献报道六神曲中存在米酵菌酸残留的现象。而六神曲制备工艺中最关键的步骤是药材混合后加入面粉和麦麸发酵, 发酵过程中面粉和麦麸很有可能被椰毒假单胞菌污染, 进而产生米酵菌酸。发酵米面和银耳仅含有一种物质, 基质相对单一。六神曲的组方中共有6种药材, 与发酵米面和银耳相比含有的化学成分更多, 基质更为复杂。因此亟须建立一种高效、灵敏、快速的检测方法确认六神曲中是否存在米酵菌酸残留。因此本文建立了超高效液相色谱-串联质谱法快速测定六神曲中的米酵菌酸, 为六神曲中米酵菌酸残留的日常监管和风险监控提供研究基础。

1 实验部分

1.1 仪器、试剂与材料

Waters UPLC Xevo TQ-S超高效液相色谱-串联质谱仪, 含有超高效液相色谱仪、电喷雾电离(ESI)源和三重四极杆质量分析器(美国沃特世公司); AE-200型万分之一和XS105DU型十万分之一电子天平(瑞士梅特勒-托利多公司); SK5200HP型超声波提取器(上海科导公司); MILLI-Q超纯水制备仪(美国密理博公司)。

米酵菌酸标准品(纯度为95%, 批号:CDAF-B6179)购自美国Sigma公司; 甲醇和乙腈(色谱纯)购自美国默克公司; 甲酸(质谱纯)购自美国Anaquachemical Supply公司; 水为Milli-Q制备的超纯水; Oasis MAX阴离子固相萃取小柱购自美国Waters公司; 六神曲样品购自本地中药材市场。

1.2 标准溶液配制

取米酵菌酸标准品10.56 mg, 用甲醇配制成100 μg/mL的标准储备液, 于-20 ℃棕色试剂瓶中避光保存。取适量米酵菌酸标准储备液, 用乙腈-含0.1%(体积分数)甲酸的10 mmoL/L甲酸铵溶液(50:50, v/v)进行稀释, 配制成质量浓度分别为0.5、1、5、10、50、100 μg/L的系列标准溶液; 分别取适量米酵菌酸标准储备液用六神曲空白提取液进行稀释, 配制成质量浓度分别为0.5、1、5、10、50、100 μg/L的系列基质标准溶液。

1.3 实验条件

1.3.1 样品前处理

准确称取已粉碎均质后的六神曲供试品(2.00±0.02) g, 置于50 mL具塞锥形瓶中, 加入甲醇20 mL, 超声30 min, 再用氨水调节pH值至8, 过滤, 取续滤液10 mL, 上Oasis MAX强阴离子交换固相萃取柱(预先分别用5 mL甲醇和5 mL水活化), 依次用5 mL水和5 mL甲醇淋洗, 抽干, 最后用8 mL含2%(体积分数)甲酸的甲醇洗脱柱子, 洗脱液于50 ℃旋转蒸发仪下蒸干, 用乙腈-含0.1%(体积分数)甲酸的10 mmoL/L甲酸铵溶液(50:50, v/v)复溶, 并定容至2 mL, 再经过0.22 μm有机微孔滤膜过滤, 待上机检测。

1.3.2 液相色谱条件

色谱柱:Waters HSS T3柱(100 mm×2.1 mm, 1.8 μm); 柱温:35 ℃; 流动相A:乙腈; 流动相B:含0.1%(体积分数)甲酸的10 mmoL/L甲酸铵溶液; 流速:0.4 mL/min。梯度洗脱程序:0~0.3 min, 50%A; 0.3~1.0 min, 50%A~90%A; 1.0~1.9 min, 90%A; 1.9~2.0 min, 90%A~50%A; 2.0~4.0 min, 50%A。进样体积:10 μL。

1.3.3 质谱条件

离子源:ESI源; 离子模式:负离子模式; 离子源温度:150 ℃; 扫描方式:多反应监测(MRM)模式; 毛细管电压:3.0 kV; 锥孔电压:20 V; 脱溶剂气温度:350 ℃; 脱溶剂气流速:650 L/h。米酵菌酸的其他质谱参数见表 1。

表 1 米酵菌酸的质谱参数 Table 1 MS parameters of bongkrekic acid

2 结果与讨论

2.1 分析条件的优化

2.1.1 质谱条件的优化

米酵菌酸的分子式为C₂₈H₃₈O₇, 相对分子质量为486.6^[8]。实验过程中, 对米酵菌酸标准溶液同时进行正离子和负离子模式全扫描, 正离子模式下准分子离子峰[M+H]⁺的m/z为487.5;负离子模式下准分子离子峰[M-H]^-的m/z为485.4, 且负离子模式下的响应值更高, 所以实验采用负离子模式电离。在ESI^-模式下, 选择m/z为485.4的离子作为母离子, 进行子离子全扫描, 得到米酵菌酸的二级质谱图。如图 1所示, 米酵菌酸在碰撞室中主要碎裂成m/z为441.4、397.3、379.3、365.3、347.3和321.4的碎片, 推测其可能的裂解途径见图 2。将一定浓度的米酵菌酸标准溶液通过灌注模式直接进质谱仪分析, 通过调谐质谱参数得到最佳响应值后选择485.4/441.4、485.4/397.3、485.4/365.3、485.4/321.4离子对作为MRM检测离子对, 其中485.4/441.4的离子对响应值最高, 故将其作为定量离子对, 其余作为定性离子对。

图 1 米酵菌酸的二级质谱图 Fig. 1 MS/MS spectrum of bongkrekic acid

图 2 米酵菌酸的质谱特征性裂解途径 Fig. 2 Typical MS fragmentation pathway of bongkrekic acid

2.1.2 色谱条件的优化

米酵菌酸为长链脂肪酸类化合物, 本身含有3个羧酸基团, 因此其在色谱柱中的保留行为受溶液pH值的影响较大。理论上，在碱性条件下，米酵菌酸极性增大, 在色谱柱上的保留能力减弱；酸性条件下其保留能力增强。实验分别考察了乙腈-10 mmoL/L甲酸铵体系、乙腈-0.1%(体积分数)甲酸水体系、乙腈-含0.1%(体积分数)甲酸的10 mmoL/L甲酸铵溶液体系和乙腈-氨水溶液(pH=8)体系进行梯度洗脱时的分离效果。结果表明，采用乙腈-含0.1%(体积分数)甲酸的10 mmoL/L甲酸铵溶液体系时，米酵菌酸能得到良好的峰形、最佳的分离效果和稳定的响应值; 采用乙腈-氨水溶液(pH=8)时的响应值最高, 但峰形较差, 且保留时间过短。同时分别对有机相进行考察, 在甲醇条件下, 米酵菌酸峰形较差, 且色谱柱压力过高。因此实验选择乙腈-含0.1%(体积分数)甲酸的10 mmoL/L甲酸铵溶液作为流动相进行梯度洗脱。

实验同时考察了Waters BEH C18色谱柱(100 mm×2.1 mm, 1.7 μm)和Waters HSS T3色谱柱(100 mm×2.1 mm, 1.8 μm)的分离效果。在乙腈-含0.1%(体积分数)甲酸的10 mmoL/L甲酸铵溶液作为流动相的条件下, 通过调节梯度洗脱程序、流速等色谱参数来确定最佳色谱条件。结果显示, 米酵菌酸在Waters HSS T3色谱柱上能够得到最佳的分离效果和稳定的响应值, 因此最终选择Waters HSS T3色谱柱(100 mm×2.1 mm, 1.8 μm)分离标准品和样品溶液。

标准品和阳性样品(样品编号:shenqu5)的色谱图见图 3。

图 3 标准品和阳性样品(shenqu5)的色谱图 Fig. 3 Chromatograms of a standard sample and the positive sample (shenqu5)

2.2 前处理条件的优化

米酵菌酸为有机酸, 为了得到最好的提取净化效果和良好的回收率, 最适宜采用阴离子固相萃取小柱处理样品。实验考察了采用MAX强阴离子交换萃取小柱和WAX弱阴离子交换萃取小柱时米酵菌酸的回收率。取阴性六神曲样品, 加入一定量的米酵菌酸标准品, 分别用MAX和WAX小柱按照1.3.1节所述处理样品。实验结果显示, MAX萃取柱能够很好地吸附米酵菌酸, 在5 mL水和5 mL甲醇洗脱液中均检测不到米酵菌酸, 仅在2%(体积分数)甲酸甲醇洗脱液中检测到米酵菌酸, 其回收率大于80%; WAX萃取柱对于米酵菌酸的吸附效果较差, 在5 mL水和5 mL甲醇洗脱液中均能检测到米酵菌酸, 米酵菌酸的回收率仅为50%。故实验最终采用MAX强阴离子固相萃取小柱处理样品。

2.3 基质效应的考察

六神曲为六种中药材经过发酵制成的曲剂中药, 成分较为复杂, 有可能对质谱离子化产生影响, 为了保证实验的准确性, 需要考察六神曲中米酵菌酸测定的基质效应。使用流动相配制质量浓度为0.5、1、5、10、50、100 μg/L的标准工作溶液。使用检测结果为阴性的六神曲样品制备空白基质提取液, 通过空白基质提取液制备相同浓度的基质标准工作液。分别进样测定标准工作液和基质标准工作液, 以质量浓度为横坐标, 相应的峰面积为纵坐绘制标准曲线和基质标准曲线。本文参照凌阿茹等^[17]的描述, 用信号增强或抑制的程度(SSE)来评价基质效应, 计算公式如下:

S₁和S₂分别为基质标准曲线和溶剂标准曲线的斜率。SSE值在80%~120%范围内为正常值; 当SSE高于120%时, 表示存在信号增强效应; 当SSE低于80%时, 表示存在信号抑制效应^[18]。经过测定, 六神曲中米酵菌酸的基质效应为91.4%, 在正常范围内, 不存在增强和抑制效应, 因此实验采用溶剂标准曲线来进行定量分析。

2.4 方法学考察

2.4.1 线性关系、检出限和定量限

取质量浓度分别为0.5、1、5、10、50、100 μg/L的系列溶剂标准溶液, 按照1.3.2节和1.3.3节实验条件进行分析, 以米酵菌酸的峰面积为纵坐标(Y)、相应的质量浓度为横坐标(X, μg/L)绘制标准曲线(见表 2)。用空白基质溶液稀释米酵菌酸标准溶液, 然后按1.3节条件进行测定, 以信噪比(S/N)为3和10时的含量分别确定米酵菌酸的检测限(LOD)和定量限(LOQ), 结果见表 2。

表 2 米酵菌酸的线性方程、线性范围、相关系数、检出限和定量限 Table 2 Linear equation, linear range, correlation coefficient (R²), LOD and LOQ of bongkrekic acid

由表 2可知, 米酵菌酸在0.5~100 μg/L范围内线性关系良好, 相关系数(R²)>0.99。米酵菌酸在六神曲中的检出限为0.4 μg/kg, 定量限为1.2 μg/kg, 说明方法灵敏度高, 可适于六神曲样品中米酵菌酸的检测。

2.4.2 回收率与精密度

精密称取阴性样品2 g, 在其中加入米酵菌酸标准品适量, 按照1.3节描述制备供试品溶液, 并进行仪器测定, 用外标法计算回收率, 结果见表 3。对加标水平分别为1.2、20.0、100.0 μg/kg的样品连续测定6次, 连续测定3 d, 计算方法的日内和日间精密度。

表 3 米酵菌酸的加标回收率和日内、日间精密度(n=6) Table 3 Spiked recoveries, precisions of intra-day and inter-day of bongkrekic acid (n=6)

结果表明，米酵菌酸的加标回收率为80.6%~85.3%, 日内和日间精密度分别为4.2%~6.8%和8.2%~13.2%。说明本方法回收率好, 准确性高。

2.5 实际样品分析

应用本方法对购自市场上的10批六神曲样品进行检测, 10批样品中只有4批样品未检出米酵菌酸, 6批样品为阳性结果, 检出了米酵菌酸, 其含量最高达到了108.4 μg/kg, 最低为8.9 μg/kg。

3 结论

本文建立了六神曲中米酵菌酸残留的检测方法。本方法快速、简便, 准确性高, 可适用于六神曲中米酵菌酸残留的风险监控。实际样品测定中, 揭示了六神曲中存在生物毒素米酵菌酸污染的现状, 为中药材和相关保健食品的安全性控制提供了研究基础, 建议有关部门加强相应的监管工作。

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