分散固相萃取结合气相色谱-高分辨质谱快速筛查酱油中多种氯丙醇


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黄超群, 陈钦可, 陈丽, 王云宇, 马喆, 沈咪, 黄佳波

浙江省检验检疫科学技术研究院, 浙江杭州 310016

收稿日期：2019-03-14

通讯联系人：黄超群, Tel:(0571)81100300, E-mail:huangchaoqun18@163.com

摘要：建立了酱油中1，3-二氯-2-丙醇、2，3-二氯-1-丙醇、3-氯-1，2-丙二醇和2-氯-1，3-丙二醇的分散固相萃取-气相色谱-高分辨质谱快速筛查检测方法。样品采用乙酸乙酯提取，提取液浓缩后经N-丙基乙二胺净化，气相色谱-高分辨质谱测定，内标法定量。结果表明，该方法对于酱油中4种氯丙醇的定量限为0.5~10 μg/kg。在3个浓度水平下的加标回收率为78%~103%；相对标准偏差均不大于8.8%。该方法快速、简便、准确、灵敏，可作为酱油中4种氯丙醇的有效检测方法。

关键词：分散固相萃取气相色谱-高分辨质谱氯丙醇酱油

Determination of multiple chloropropanols in soy sauce by dispersive solid phase extraction-gas chromatography-high resolution mass spectrometry

HUANG Chaoqun, CHEN Qinke, CHEN Li, WANG Yunyu, MA Zhe, SHEN Mi, HUANG Jiabo

Zhejiang Academy of Science and Technology for Inspection and Quarantine, Hangzhou 310016, China

Abstract: A method for the rapid screening of 1, 3-dichloro-2-propanol, 2, 3-dichloro-1-propanol, 3-monochloropropane-1, 2-diol, and 2-monochloropropane-1, 3-diol in soy sauce was developed based on dispersive solid phase extraction-gas chromatography-high resolution mass spectrometry (GC-HRMS). The samples were extracted by ethyl acetate, cleaned up using N-propylethylenediamine and detected by GC-HRMS. The chloropropanols were quantified by the internal standard method. The results demonstrated that the limits of quantitation of the four chloropropanols were in the range of 0.5-10 μg/kg. The recoveries of the four chloropropanols in soy sauce spiked with three levels varied from 78% to 103%, and the relative standard deviations were no more than 8.8%. The proposed method is simple, accurate, sensitive and suitable for the rapid screening of the four chloropropanols in soy sauce.

Key words: dispersive solid phase extraction gas chromatography-high resolution mass spectrometry (GC-HRMS) chloropropanol soy sauce

随着人们生活水平的提高, 调味品的需求量大大增加, 传统的通过长时间微生物发酵、水解蛋白质生产得到的调味品已无法满足需求, 随之产生了添加水解植物蛋白质的复合调味品, 其中就包含配制酱油。水解植物蛋白质是植物性蛋白质在盐酸催化及高温条件下水解后的产物。其水解速度快, 可极大缩短生产周期, 降低成本; 同时水解植物蛋白质中含有的氨基酸系列物质, 能增加食品中的营养成分。但是, 在酸水解过程中发生的副反应也会产生3-氯-1, 2-丙二醇(3-MCPD)等氯丙醇类物质^{[1, 2]}。这类物质具有致癌性, 也会引起不育症, 其中以3-MCPD的毒性最大。因此, 各个国家、组织对调味品中3-MCPD都着有严格的限量规定:我国^[3]与国际食品法典委员会(CAC)^[4]对于添加了酸水解植物蛋白质的液态调味品中3-MCPD规定的限量为0.4 mg/kg; 欧盟^[5]对于3-MCPD在水解植物蛋白质及酱油中的限量更为严格, 均为0.02 mg/kg。

目前, 食品中氯丙醇的检测通常采用固相萃取净化, 用七氟丁酰咪唑等衍生试剂将氯丙醇衍生后, 利用气相色谱-质谱法^{[2, 6-9]}或气相色谱-串联质谱法^[10]进行测定。在此类方法中, 衍生步骤复杂, 衍生物稳定性较差, 给氯丙醇的准确测定带来了一定难度。同时, 衍生试剂昂贵, 增加了检测成本。因此, 有研究人员尝试采用非衍生化法测定氯丙醇的含量, 且已有文献报道采用固相萃取^[11]或在线凝胶色谱^[12]净化后, 用气相色谱-串联质谱非衍生化法测定氯丙醇的方法。

相较于固相萃取或凝胶色谱净化方法, 分散固相萃取是一种更为快速、简便的前处理方法。分散固相萃取结合具有高质量精度、高通量等优势的高分辨质谱技术, 已在食品残留分析检测领域得到应用^[13-16], 而其应用于食品中氯丙醇含量的测定方法未见报道。基于此, 本研究采用分散固相萃取进行前处理, 应用气相色谱-高分辨质谱技术, 实现了酱油中4种氯丙醇含量的同时快速筛查检测。本文建立的方法具有前处理易操作、定性定量准确等特点, 满足日常酱油中多种氯丙醇含量的检测需求。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

PEGASUS GC-HRT气相色谱-高分辨质谱仪, 配电子轰击源(美国Leco公司); AE260电子天平(瑞士Mettler公司); YP502N电子天平(上海舜宇恒平科学仪器有限公司); MS3 BASIC涡旋混合器(德国IKA公司); P300H超声波清洗器(德国ELMA公司); N-1100旋转蒸发仪(日本东京理化器械株式会社); MULTIFUGE X1R离心机、SORVALL LEGEND MICRO 17R离心机(美国Thermo公司)。

1, 3-二氯-2-丙醇(1, 3-DCP, 纯度99.6%)、五氘代2, 3-二氯-1-丙醇(D₅-2, 3-DCP, 纯度98.0%)、五氘代2-氯-1, 3-丙二醇(D₅-2-MCPD, 纯度98.0%)购自北京曼哈格生物科技有限公司; 2, 3-二氯-1-丙醇(2, 3-DCP, 纯度98.0%)、2-氯-1, 3-丙二醇(2-MCPD, 纯度98.0%)购自加拿大TRC公司; 3-MCPD(纯度99.3%)购自德国Dr. Ehrenstorfer公司; 五氘代1, 3-二氯-2-丙醇(D₅-1, 3-DCP, 纯度99.2%)、五氘代3-氯-1, 2-丙二醇(D₅-3-MCPD, 纯度97.5%)购自加拿大CDN公司; 乙酸乙酯(色谱纯)购自西班牙Scharlau公司; N-丙基乙二胺(PSA)购自上海安谱实验科技股份有限公司。

1.2 标准溶液的配制

1.2.1 标准储备液

准确称取氯丙醇及氘代氯丙醇标准物质各10 mg, 用乙酸乙酯溶解, 分别转移至8个50 mL容量瓶中, 用乙酸乙酯定容至刻度, 摇匀, 配制成浓度为200 mg/L的标准储备液。

1.2.2 标准中间液

准确移取25 μL 1, 3-DCP、50 μL 2, 3-DCP、250 μL 2-MCPD和500 μL 3-MCPD标准储备液至同一10 mL容量瓶中, 用乙酸乙酯定容, 配制成3-MCPD质量浓度为10 mg/L的氯丙醇混合标准中间液; 准确移取25 μL D₅-1, 3-DCP、50 μL D₅-2, 3-DCP、250 μL D₅-2-MCPD和500 μL D₅-3-MCPD标准储备液至同一10 mL容量瓶中, 用乙酸乙酯定容, 配制成D₅-3-MCPD质量浓度为10 mg/L的氘代氯丙醇混合标准中间液。

1.2.3 标准工作液

准确移取氯丙醇混合标准中间液20、50、100、200和500 μL于10 mL容量瓶中, 分别加入100 μL氘代氯丙醇混合标准中间液, 用乙酸乙酯定容, 配制成3-MCPD质量浓度分别为20、50、100、200和500 μg/L的标准工作液。

1.3 样品前处理

1.3.1 提取

称取2 g(精确至0.01 g)试样于50 mL离心管中, 加入10 μL氘代氯丙醇混合标准中间液和20 mL乙酸乙酯, 涡旋0.5 min, 超声10 min, 以4000 r/min的速度离心3 min, 移取上层溶液至150 mL浓缩瓶。下层残余物用20 mL乙酸乙酯重复提取一次, 合并乙酸乙酯层至同一浓缩瓶中, 于40 ℃浓缩至近干, 用乙酸乙酯定容至1 mL, 待净化。

1.3.2 净化

将上述溶液转移至装有150 mg PSA的1.5 mL离心管中, 涡旋1 min, 以10000 r/min的速度离心3 min。取上清液, 过膜后供气相色谱-高分辨质谱仪检测。

1.4 仪器条件

1.4.1 色谱条件

色谱柱:DB-WAX(30 m×0.25 mm×0.25 μm); 柱温:初始100 ℃, 保持2.0 min, 以15 ℃/min的速率升温至220 ℃, 保持5 min; 进样口温度:230 ℃; 传输线温度:250 ℃; 载气:氦气, 纯度≥99.999%, 流量为1.5 mL/min; 进样量:2.0 μL; 进样方式:不分流进样。

1.4.2 质谱条件

离子源:电子轰击(EI)源; 电离能量:70 eV; 离子源温度:200 ℃; 分辨率:≥20000;溶剂延迟:5.0 min; 4种氯丙醇及其同位素内标监测离子保留时间、质荷比信息见表 1。

表 1 4种氯丙醇及其同位素内标监测参数 Table 1 Monitoring parameters for the four chloropropanols and their isotope internal standards

2 结果与讨论

2.1 监测离子质荷比的确定

按1.4节方法分别对4种10 mg/L氯丙醇及同位素内标进行高分辨质谱全扫描, 获得目标物的保留时间、碎片离子等信息, 选择一个灵敏度高、干扰少的碎片离子作为目标物的定性、定量离子。图 1为3-MCPD的全扫描高分辨质谱图, 对其各主要碎片离子在实际样品中的灵敏度及其干扰情况进行考察, 结果如图 2a~2d所示。质荷比为78.9944的离子相较于其他离子具有更高的信噪比, 而且受干扰也少。若采用普通低分辨质谱进行检测, 碎片离子m/z 79受到较大干扰, 无法准确定性和定量(见图 2e), 因此选择m/z 78.9944作为3-MCPD的高分辨质谱监测离子。同样地, 确定了其他3种氯丙醇的监测离子, 详见表 1。

图 1 3-MCPD的全扫描质谱图 Fig. 1 Full scan spectrum of 3-MCPD

图 2 酱油样品中3-MCPD的选择离子色谱图 Fig. 2 SIM chromatograms of 3-MCPD in soy sauce sample a. m/z 43.0182; b. m/z 44.0258; c. m/z 61.0285; d. m/z 78.9944; e. m/z 79.

2.2 提取溶剂的优化

4种氯丙醇类化合物溶于甲醇、乙腈、乙醚、乙酸乙酯等有机溶剂, 实验中选用乙腈、乙酸乙酯作为提取剂, 通过加标回收试验, 比较了2种提取剂对氯丙醇类化合物的提取效果。结果表明, 乙腈、乙酸乙酯对氯丙醇类化合物的提取效率均在90%以上, 然而采用乙腈作为提取液时带入了更多的杂质。图 3a和3b为采用2种提取剂处理后的酱油样品的总离子图, 采用乙腈作为提取液, 总离子图上杂质峰明显多于乙酸乙酯。因此, 本研究采用乙酸乙酯作为提取溶剂。

图 3 不同处理条件下酱油样品的总离子图 Fig. 3 Total ion chromatogram of soy sauce sample treated under different conditions a. Extracted by acetonitrile, without clean-up; b. extracted by ethyl acetate, without clean-up; c. extracted by ethyl acetate, treated with 50 mg N-propylethylenediamine (PSA); d. extracted by ethyl acetate, treated with 150 mg PSA. Peak 1. levulinic acid; peak 2. benzoic acid.

2.3 分散固相萃取条件的优化

酱油的成分复杂, 包含多种氨基酸、糖类、有机酸、色素及香料等成分。而PSA作为一种净化剂, 常被用于分散固相萃取方法以除去样品中糖类、有机酸和色素^[17], 因此本研究考察了PSA对于酱油的净化效果, 并对其用量进行优化。

为确定提取后样液中存在的主要杂质, 对大量未经净化的样液进行了筛查。结果表明, 样品总离子图上主要存在两个明显的杂质峰(见图 3b)。对其质谱图分析得出, 两种化合物分别为乙酰丙酸(Peak 1)和苯甲酸(Peak 2)。乙酰丙酸也是植物蛋白质酸水解发生的副反应产物^[18], 而苯甲酸是一种酱油中常用的防腐剂, GB 2760-2014规定酱油中苯甲酸限量为1.0 g/kg。PSA的加入, 能有效祛除酱油提取液中这两种化合物(见图 3c和3d)。对其用量优化表明, 当PSA用量为150 mg时, 所筛查酱油样品中乙酰丙酸和苯甲酸能被完全祛除。因此, 本研究确定的PSA用量为150 mg。

2.4 方法学考察

2.4.1 线性范围和定量限

在确定的色谱和质谱条件下, 对标准工作液进行测定, 以氯丙醇化合物质量浓度(X, μg/L)为横坐标、氯丙醇化合物与其同位素内标峰面积之比(Y)为纵坐标绘制标准曲线。结果表明, 4种氯丙醇化合物线性关系良好, 相关系数均大于0.999, 其线性范围、线性方程及相关系数详见表 2。同时, 根据样液中4种氯丙醇化合物的响应情况, 确定了酱油中4种氯丙醇化合物各自的定量限(S/N≥10), 满足国内外对于3-MCPD的限量要求。

表 2 4种氯丙醇化合物的线性范围、线性方程、相关系数和定量限 Table 2 Linearity ranges, linear equations, correlation coefficient, and limits of quantitation (LOQs) of the four chloropropanols

2.4.2 回收率和精密度

在空白酱油样品中分别添加3个浓度水平的4种氯丙醇化合物, 每个浓度水平重复测定6次, 计算回收率及其相对标准偏差。如表 3所示, 酱油中4种氯丙醇化合物的回收率范围为78%~103%, 相对标准偏差均不大于8.8%。本方法能够满足酱油中4种氯丙醇快速筛查检测的要求。

表 3 酱油中4种氯丙醇的加标回收率和精密度(n=6) Table 3 Recoveries and precisions of the four chloropropanols in soy sauce (n=6)

2.5 实际样品检测

采用本方法与标准方法GB 5009.191-2016(第二法)对3-MCPD检出的样品进行测定, 两种方法的检测结果基本一致(见表 4)。相较于GB 5009.191-2016, 本方法无需固相萃取净化及衍生化反应, 更为简便快速, 试剂耗材成本更低。

表 4 采用不同方法的3-MCPD测定结果 Table 4 Results for 3-MCPD determined by different methods

3 结论

本研究建立了一种分散固相萃取结合气相色谱-高分辨质谱测定酱油中4种氯丙醇的分析方法。该方法实验过程不涉及复杂的样品前处理过程, 简单、快速、高效, 准确度、灵敏度、精密度均较高, 能满足日常酱油中4种氯丙醇的快速定性筛查和定量测定。

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