色谱  2019, Vol. 37 Issue (9): 996-1003     DOI: 10.3724/SP.J.1123.2019.03030   PDF    
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宋卫得
苏征
惠希东
许崇龙
杜利君
张传杰
离子色谱-积分脉冲安培检测法同时测定酱油中20种氨基酸和6种糖
宋卫得1, 苏征1, 惠希东1, 许崇龙1, 杜利君2, 张传杰1     
1. 日照海关, 山东 日照 276826;
2. 太原海关, 山西 太原 030024
收稿日期：2019-03-22
基金项目：国家质检总局科技项目（2017IK220，2015IK215，2016IK212）
通讯联系人：宋卫得, E-mail:woxinyh2006@163.com
摘要：建立了梯度淋洗-离子色谱-积分脉冲安培检测法同时测定酱油中20种氨基酸和6种糖的方法，通过对色谱柱温度、pH值、放置时间等实验影响因素的考察，探索出了适合26种组分测定的多级梯度淋洗条件。结果表明，当流速为0.25 mL/min，pH值在5.2~6.7，柱温在35℃时，26种组分在各自的浓度范围内具有良好的线性关系（r2 ≥ 0.995）。除了谷氨酰胺、亮氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸外，其他22种组分的检出限均小于0.03 mg/L；在0.20、0.50、2.00 mg/L 3个添加水平下，回收率为84.2%~109%，RSD为2.7%~7.8%。该方法高效、简便、灵敏、准确，可用于酱油中多种氨基酸和糖的同时测定以及掺假辨别技术研究。
关键词：离子色谱    梯度淋洗    积分脉冲安培检测    氨基酸    糖    酱油    
Simultaneous determination of twenty amino acids and six carbohydrates in soy sauce by ion chromatography with integrated pulsed amperometric detection
SONG Weide1, SU Zheng1, HUI Xidong1, XU Chonglong1, DU Lijun2, ZHANG Chuanjie1     
1. Rizhao Customs, Rizhao 276826, China;
2. Taiyuan Customs, Taiyuan 030024, China
Foundation item: Science and Technology Program for General Administration of Quality Supervision, Inspection and Quarantine of China (Nos. 2017IK220, 2015IK215, 2016IK212)
Abstract: A method of gradient elution ion chromatography with integrated pulsed amperometric detection for simultaneous determination of twenty amino acids and six carbohydrates in soy sauce was established. The effects of column temperature, pH value of solution, and standing time were studied, and then the suitable gradient elution conditions were found for the determination. In the conditions that the flow rate is 0.25 mL/min, pH value of solution is in the range of 5.2-6.7, temperature of column is 35℃, the linear relationships of the 26 components are good and the correlation coefficients are not less than 0.995. Except glutamine, leucine, isoleucine and methionine, the limits of detection (S/N=3) of the other 22 components are less than 0.03 mg/L. The recoveries of the 26 components in soy sauce are 84.2%-109% at the spiked levels of 0.20, 0.50, 2.00 mg/L, and the relative standard deviations (RSDs) are in the range of 2.7%-7.8%. The method is efficient, easy, sensitive, and accurate for simultaneous determination of amino acids and carbohydrates in soy sauce, and can provide an effective research technique for adulterated soy sauce.
Key words: ion chromatography (IC)     gradient elution     integrated pulsed amperometric detection     amino acid     carbohydrate     soy sauce    

酱油是中国传统的调味品, 是人们日常饮食生活中的必需品。在酱油酿造发酵时, 会产生丰富的氨基酸和糖类。氨基酸是生命延续过程必须摄取的重要成分[1, 2], 是酱油中主要的营养成分和鲜味物质, 氨基酸的含量越高, 酱油的质量等级越高。糖类是酱油中主要的甜味物质和重要的调味物质, 可以掩盖酱油的咸味、酸味、苦味, 酱油中的糖主要有葡萄糖、麦芽糖、海藻糖、三氯蔗糖等, 其中, 三氯蔗糖是一种人工添加的功能性甜味剂, 我国食品安全标准中规定其最大使用限量为0.25 g/kg。

目前, 氨基酸和糖的分析方法主要有气相色谱法、气相色谱-质谱联用法[3]、液相色谱法[4]、液相色谱-串联质谱法[5]、离子色谱法[6]、同位素质谱法[7]等, 但氨基酸和糖同时测定的报道很少。Lin等[5]采用液相色谱-质谱法测定了大枣中20种氨基酸, 测定灵敏度高, 但其中5种组分的回收率较低, 为54.8%~69.2%, 影响定量的准确性; 徐人杰等[8]采用液相色谱法测定了茶树花中3种可溶性糖和16种游离氨基酸, 但需要采用3种不同的前处理方法和仪器条件进行分类测定, 其中氨基酸采用邻苯二甲醛(OPA)和苯磺酰氯两种衍生化方法, 测定步骤相对复杂; Yu等[9]利用离子色谱法测定了17种氨基酸和9种糖类, 文中5种研究组分与本文所研究的组分不同, 其研究侧重点在于流动相的选择; 本文的侧重点在于研究色谱柱温度、溶液pH值、放置时间对26种组分的影响。当前氨基酸和糖类测定方法存在的不足是一次性同时测定组分数量少, 且对实验影响因素的研究不够深入。离子色谱-积分脉冲安培检测法利用在特定电极上、特定电压下发生氧化反应的分析物具有专一性, 其他化合物不能被检测到这一机理, 可以一次性同时测定多种氨基酸和糖, 而且该方法具有简便、快速、灵敏、准确等技术优势[10-13]。

本文利用ICS5000+型双系统离子色谱仪, 采用积分脉冲安培检测和多级梯度淋洗相结合的方式, 通过对色谱柱温度、多级梯度条件、溶液pH值、放置时间等实验影响因素进行深入分析研究, 建立了酱油中20种氨基酸和6种糖同时测定的方法。

1 实验部分
1.1 仪器、试剂与材料

离子色谱仪(美国Thermo Fisher公司, ICS 5000+), 配备安培检测器和自动进样器(AS-AP); 纯水仪(美国Millipore公司, Milli-Q); 20种氨基酸标准品(纯度＞98.0%, 上海安谱科学仪器有限公司), 葡萄糖、麦芽糖、海藻糖、乳糖、蔗糖、三氯蔗糖标准品(纯度＞99.0%, Dr. Ehrenstorfer公司); 氢氧化钠溶液(质量分数为50%, Fisher Chemical公司); 醋酸钠(纯度＞99.9%, Thermo Scientific公司); IC-RP10净化柱(1.0 mL, Agela Technologies公司)。

1.2 实验条件
1.2.1 离子色谱条件

色谱柱:AminoPac PA10(250 mm×2.0 mm); 保护柱:AminoPac PA10(50 mm×2.0 mm); 检测模式:积分脉冲安培检测; 工作电极:金电极; 参比电极:pH电极; 电位波形:Glod, pH-Ag-AgCl RE, AAA; 流动相:A为NaOH溶液(225 mmol/L), B为去离子水, C为醋酸钠溶液(1.00 mol/L); 流速:0.25 mL/min; 柱温:35 ℃; 进样量:25 μL。梯度淋洗条件见表 1。

表 1 离子色谱梯度淋洗条件 Table 1 Gradient elution conditions for ion chromatography
1.2.2 前处理方法

准确取酱油待检样品0.100 g, 加入去离子水约150 mL, 摇匀静置15 min, 调节稀释液pH值至5.2~6.7, 全部转移至200 mL容量瓶中, 采用去离子水定容至刻度, 摇匀、静置15 min, 取10.0 mL溶液, 先过0.22 μm水相滤膜, 再过已经预活化(依次过10 mL甲醇、15 mL去离子水)的IC-RP10净化柱, 弃去前3 mL, 收集流出液, 待上机检测。

2 结果与讨论
2.1 实验条件考察
2.1.1 梯度淋洗条件的选择

一般淋洗梯度条件难以实现26种组分的有效分离, 为提高检测灵敏度和分离度, 根据淋洗时间段和淋洗浓度进行了50多次实验对比研究, 最终确定了表 1中多级梯度淋洗条件。其中淋洗时间被分为5段:0~11.5、11.5~17.0、17.0~23.5、23.5~40.0、40.1~50.0 min, 初始淋洗浓度是整个多级梯度淋洗条件的基础, 改变初始浓度直接影响率先洗脱组分的分离选择性, 经过对比筛选, 以45 mmol/L氢氧化钠溶液作为初始淋洗浓度, 恰好能够实现前13种弱保留组分的有效分离。11.5~17.0 min, 氢氧化钠浓度逐步增至90 mmol/L, 此时组分14~17实现分离; 17.0~23.5 min, 逐步加入强极性淋洗液醋酸钠溶液, 为中强保留组分的快速洗脱做准备。23.5~40.0 min, 选用氢氧化钠溶液、醋酸钠溶液、去离子水(配比24:40:36)进行洗脱, 可使组分18~25完全分离。40.1~50.0 min, 为加快洗脱强保留组分色氨酸, 同时确保其灵敏度, 选择氢氧化钠和醋酸钠(体积比为50:50)洗脱液。图 1(35 ℃)是26种组分混合标准溶液的离子色谱图。

图 1 不同色谱柱温度下26种组分混合标准溶液测定的离子色谱图 Fig. 1 Ion chromatograms of a mixed standard solution of 26 components at different column temperatures Peaks: 1. arginine; 2. trehalose; 3. lysine; 4. glutamine; 5. asparagine; 6. glucose; 7. alanine; 8. threonine; 9. glycine; 10. valine; 11. sucrose; 12. serine; 13. proline; 14. D-lactose; 15. isoleucine; 16. leucine; 17. methionine; 18. maltose; 19. histidine; 20. phenylalanine; 21. glutamic acid; 22. aspartic acid; 23. cysteine; 24. sucralose; 25. tyrosine; 26. tryptophane.
2.1.2 色谱柱温度的选择

温度是影响离子交换速率和分离选择性的重要因素[14], 但是关于温度对离子色谱分离氨基酸和糖的影响当前研究较少。根据待测物的物化性质和分离特性, 选取了6个温度进行分析(见图 1)。

从总体上来看, 在同一实验测定条件下, 在研究温度范围内, 组分1(精氨酸)、组分2(海藻糖)、组分3(赖氨酸)、组分4(谷氨酰胺)、组分5(天冬酰胺)和组分18(麦芽糖)、组分19(组氨酸)、组分20(苯丙氨酸)、组分21(谷氨酸)、组分22(天冬氨酸)、组分23(半胱氨酸)、组分24(三氯蔗糖)、组分25(酪氨酸), 几乎不受温度的影响, 保留时间和灵敏度没有明显变化, 因为这些物质是极性带电或含有极性较强侧链基团组分, 它们与色谱柱的作用力主要是库仑力(电荷力)和侧链基团作用力, 温度影响相对较小。而中间时间段出峰的组分6至组分17, 主要是非极性、极性不带电氨基酸和糖类, 受温度影响较大。

从分离度来看, 26、28、30、32、35、38 ℃时, 出峰组分数量分别为23、25、25、25、26、25种。从图 1中看出, 26 ℃时, 有3对组分出现共洗脱, 分别是组分6和7、组分12和13、组分14和15; 28 ℃时, 组分6和7共洗脱, 不能满足定性和定量分析要求; 30 ℃和32 ℃时, 组分11分别与组分13、12重叠; 38 ℃, 组分10和11以及组分16和17共洗脱; 而35 ℃时, 26种组分有效分离, 总体分离度最好。

从保留时间和灵敏度来看, 组分6(葡萄糖)、组分10(缬氨酸)、组分11(蔗糖)、组分14(D-乳糖)、组分15(异亮氨酸)、组分16(亮氨酸)和组分26(色氨酸), 这7种组分受温度影响最明显。其中葡萄糖、蔗糖、乳糖、色氨酸随着温度的升高, 保留时间缩短, 受温度影响最大的组分是蔗糖, 保留时间由14.1 min缩短至10.3 min, 而且其在混合组分中的出峰顺序也发生了显著改变; 色氨酸出峰时间从50.3 min缩至44.1 min, 葡萄糖和乳糖出峰时间也有所缩短。蔗糖、乳糖、葡萄糖分子中均含有与苯环相类似电子结构的含氧六元吡喃环, 而蔗糖分子中更是含有一个吡喃和一个呋喃(含氧五元杂环)两个杂环结构, 色氨酸是一种β-吲哚基丙氨酸, 吲哚基含有苯环结构, 这4种物质均含有类苯环的分子结构, 而色谱柱内骨架基质是苯乙烯-二乙烯基苯的共聚物。从分析化学角度上, 首先, 组成和结构相似的物质, 相对分子质量越大, 范德华力越大, 这4种组分与色谱柱基质含有相似的苯环或者类苯环结构, 因此产生了很强的范德华力; 其次, 极性较大的分子间产生的范德华力以取向力(静电引力)为主, 而取向力与温度成反比, 温度越高, 取向力越弱, 组分越易洗脱, 因此, 这4种组分保留时间缩短。缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸, 随着温度的升高, 保留时间却逐步增大, 这3种组分均是相对分子质量较小的非极性氨基酸, 与色谱柱功能基季铵盐(-NR3)中烷基的作用力主要来自其侧链基团疏水性强的烷基[15], 而非极性的烷基之间产生的范德华力主要是色散力。首先, 色散力与相互作用分子的变形性成正比; 其次, 烷基具有热裂解性, 温度升高, 烷基链增长, 分子变形性增大, 色散力变大, 因此, 3种氨基酸保留增强。马亚杰等[16]发现这3种氨基酸在色谱柱上的保留行为是吸热反应, 符合范特霍夫曲线, 温度升高, 保留增强, 从热力学角度证实了此结论。

从系统压力来看, 随着温度的升高, 色谱柱内填料活性更高, 系统压力逐步降低, 由26 ℃时的20.0 MPa逐步降至38 ℃时的15.4 MPa; 26 ℃和28 ℃时, 最大压力分别为20.0和18.7 MPa, 接近工程师建议的压力上限20.7 MPa, 而35 ℃和38 ℃时, 系统最大压力为16.0和15.4 MPa, 此时压力适中, 系统稳定性好。

综上所述, 温度对疏水性氨基酸和吡喃糖类影响较大, 对亲水性、酸性、碱性氨基酸影响较小, 实际操作时, 可以通过改变柱温来优化分离度和选择性。本实验选择35 ℃分析26种氨基酸和糖。

2.1.3 pH值对测定的影响

分别移取相同体积的10份标准储备液, 调节为不同pH值, 定容至相同体积, 此时每份溶液中26种氨基酸和糖的理论浓度相同, pH值在2.0~13.0之间, 依次上机测定。结果表明, 苏氨酸、甘氨酸、蛋氨酸、半胱氨酸、色氨酸、海藻糖、蔗糖这7种组分几乎不受pH值的影响, 在酸性和碱性条件下, 测定含量均比较稳定; 而谷氨酸、丝氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、葡萄糖、乳糖、麦芽糖这9种组分测定含量受溶液pH值影响较大(见图 2)。

图 2 不同溶液pH条件下9种组分的含量 Fig. 2 Contents of nine components at different solution pH levels

从图 2中可以看出, 谷氨酸、丝氨酸是受pH值影响很大, 且受pH影响的规律一致, 在强酸和强碱性条件下测定含量均出现了大幅增大, 说明在酸碱性条件下两种组分溶液中离子含量较中性时出现明显增大; 苯丙氨酸、脯氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸这4种组分测定含量在酸碱性条件下波动较大, 当pH值小于4.0时, 测定含量是中性条件下测定含量的85.35%~128.01%, 而当pH值大于10.0时, 这4种组分测定含量波动范围是97.62%~126.91%。

氨基酸之所以受pH值影响较大, 是因为它是两性电解质, 酸性条件下, 氨基(-NH2)吸收H+带正电, 碱性条件下, 羧基(-COOH)失去H+带负电, 因此在强酸和强碱溶液中氨基酸离子含量随其电离程度大小而变化。除天冬氨酸等电点为2.77、谷氨酸为3.22、赖氨酸为9.74、精氨酸为10.76外, 其他16种氨基酸的等电点在5.05~7.60之间, 在等电点附近溶液中氨基酸离子的含量稳定, 因此在弱酸性条件下多数氨基酸测定含量稳定。从图 3中可以看出, 葡萄糖、乳糖、麦芽糖在强酸性条件下, 测定含量稍有降低, 但是在强碱性条件下, 葡萄糖含量逐步增大, 而乳糖、麦芽糖含量逐步降低; pH值为13.0时, 三者测定含量分别是中性条件下的121.94%、36.73%和23.42%, 这是由于3种糖中均含有游离的醛基, 是还原糖, 而乳糖和麦芽糖属于二糖, 在一定条件下可发生水解等反应转化成一定量的单糖葡萄糖, 导致所测定葡萄糖的含量有所增大。

图 3 不同放置时间下酱油样品的离子色谱图 Fig. 3 Ion chromatograms of a soy sauce sample at different standing times

氨基酸和糖含量随pH值的变化规律, 是受自身分子结构、极性、等电点、解离常数、氧化还原性等各种因素交互影响的结果, 需要进行深入研究分析。本实验选择26种组分测定含量均很稳定, pH值为5.2~6.7, 即弱酸性条件下进行分析测定。

2.1.4 放置时间对测定的影响

将一份处理好的酱油样品于20 ℃室温条件下放置一定时间, 在不同时间点取样测定。图 3是0、8、16、24、30、32、36 h 7个时间点所测得的离子色谱图。

从图 3中可以看出, 0、8、16 h这3个时间点的色谱图基本一致, 说明在16 h内组分含量稳定, 但是16 h后多数组分开始衰减。从24 h开始, 精氨酸、葡萄糖、谷氨酸均出现了一定程度的衰减; 30 h时, 脯氨酸、组氨酸、谷氨酸含量降至0 h时的52%以下。从图 3中看出, 30 h到36 h是26种组分含量衰减最快、变化最大的时间段, 36 h时多数组分测定含量已降至0 h时的20%以下。因此, 为确保26种组分定量准确, 应在16 h内上机测定完毕。

2.2 方法学考察
2.2.1 线性范围与检出限

在0.05~2.50 mg/L范围内, 进行了6个水平(0.05、0.10、0.20、0.50、1.00、2.50 mg/L)标准工作液测定和线性拟合。结果(见表 2)表明, 26种组分的线性相关系数(r2)均大于0.995, 其中19种组分的相关系数大于0.999。26种组分检出限在0.0017~0.0705 mg/L之间, 除了谷氨酰胺、亮氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸外, 其他22种组分检出限均小于0.03 mg/L。其中6种糖线性关系较好, 相关系数全部大于0.998, 检出限全部小于0.03 mg/L。

表 2 26种组分的线性范围、线性方程、相关系数及检出限 Table 2 Linear ranges, regression equations, correlation coefficients (r2) and limits of detection (LODs) of the 26 components
2.2.2 回收率与精密度

向3个不同酱油样品中添加3个水平(0.20、0.50、2.00 mg/L)的标准溶液, 每个浓度水平进行6次平行测定实验, 来验证不同酱油基质测定时方法的回收率和精密度, 根据基质浓度、添加浓度和添加后的测定浓度计算回收率。表 3列出3浓度水平、6次平行检测的平均回收率和RSD数据。

表 3 26种组分在实际样品中3个加标水平下的平均回收率及精密度(RSD)(n=6) Table 3 Average recoveries and precisions of the 26 components spiked in samples at three levels (n=6)

从表 3中可以看出, 26种组分在3种基质、3种浓度添加水平下的回收率在84.2%~109%之间, 测定数据的RSD在2.7%~7.8%范围内, 说明该测定方法准确性高、精密度好。

2.3 实际样品的分析

从市场上随机抽取5种酱油产品, 按照离子色谱条件和前处理步骤, 进行实际样品中26种氨基酸和糖含量的测定, 图 4是5种酱油样品的离子色谱图。

图 4 5种酱油样品的离子色谱图 Fig. 4 Ion chromatograms of five soy sauce samples Peak Nos. are the same as in Fig. 1.

从检出组分含量来看, 含量较高的组分依次是精氨酸、葡萄糖、谷氨酸、丙氨酸, 3种氨基酸是酱油中重要的鲜味物质, 葡萄糖是酱油的主要甜味物质。从测定稳定性来看, 检测基线平稳, 组分峰形尖锐, 分离效果理想, 几乎不受其他物质的干扰。

5种酱油中氨基酸测定含量与其质量等级完全符合, 5种酱油中氨基酸总含量依次降低, 其质量等级恰好是1号特级、2号一级、3号二级、4号三级、5号三级。研究还发现, 海藻糖、赖氨酸、苏氨酸、甘氨酸、缬氨酸、蔗糖、丝氨酸、亮氨酸, 均符合质量等级越高组分含量越大的规律。

3 结论

本文利用离子色谱仪, 采用多级梯度淋洗和积分脉冲安培检测相结合的方法, 通过对柱温、流动相配比、溶液pH值、放置时间等多种影响因素进行深入分析研究, 构建了酱油中26种氨基酸和糖类同时测定的方法, 为酱油样品中多组分的同时测定提供了一种高效、便捷、准确的技术手段。

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