色谱  2019, Vol. 37 Issue (10): 1118-1123     DOI: 10.3724/SP.J.1123.2019.03033   PDF    
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吴智超
吴恩国
杨仲毅
陶宇翔
陈潭
钟永军
高效液相色谱法测定生物转化反应液中N, N′-乙二胺二琥珀酸
吴智超1, 吴恩国2, 杨仲毅1, 陶宇翔3, 陈潭1, 钟永军1     
1. 台州学院, 浙江 台州 318000;
2. 浙江海正药业股份有限公司, 浙江 台州 318000;
3. 台州市博纳化工有限公司, 浙江 台州 318000
收稿日期：2019-03-26
基金项目：台州市科技计划项目(162gy47, 1701ny06);台州市教科规划项目(gg19007)
通讯联系人：杨仲毅, Tel:(0576)88660338, E-mail:yangzhyi@126.com
摘要：建立了高效液相色谱测定生物转化反应液中N，N'-乙二胺二琥珀酸（EDDS）含量的分析方法。采用InertSustain AQ-C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），以体积分数25%的甲醇水溶液（含有1.0 g/L一水乙酸铜、2.0 g/L四丁基氢氧化铵，以磷酸调节pH至2.80）为流动相，流速为1.0 mL/min，柱温为30℃，进样量为20 μL，检测波长为254 nm。该方法可在8 min内分离EDDS及其生物合成相关物质（苹果酸、柠檬酸、乙二胺四乙酸（EDTA）和富马酸），且峰形良好。EDDS在0.06~0.6 g/L范围内线性线性关系良好（相关系数（r）为0.9995），平均回收率为100.39%（n=9，RSD=1.15%）。EDDS生物合成反应液中EDDS含量为0.25 g/L，大部分底物被转化为苹果酸（36.56 g/L）；而EDDS的水解反应中富马酸产生较少，形成了3.05 g/L的苹果酸。该方法简便快速，灵敏可靠，适用于EDDS生物合成的研究。
关键词：高效液相色谱    反相离子对色谱    生物转化    螯合剂    N, N-乙二胺二琥珀酸    
Determination of N, N'-ethylenediamine disuccinic acid in bioconversion reaction solution using high performance liquid chromatography
WU Zhichao1, WU Enguo2, YANG Zhongyi1, TAO Yuxiang3, CHEN Tan1, ZHONG Yongjun1     
1. Taizhou University, Taizhou 318000, China;
2. Zhejiang Hisun Pharmaceutical Co., Ltd., Taizhou 318000, China;
3. Taizhou Bona Chemical Co., Ltd., Taizhou 318000, China
Foundation item: Taizhou Science and Technology Program Project (Nos. 162gy47, 1701ny06); Taizhou Education Planning Project (No. gg19007)
Abstract: A method was developed for the determination of N, N'-ethylenediamine disuccinic acid (EDDS) in bioconversion samples by high performance liquid chromatography (HPLC). An InertSustain AQ-C18 column (250 mm×4.6 mm, 5 μm) was used in the analysis. The mobile phase was 25% (v/v) methanol with 1.0 g/L Cu(CO2CH3)2·H2O, 2.0 g/L tetrabutylammonium hydroxide, and the pH was adjusted to 2.80 with phosphoric acid. The flow rate of the mobile phase was 1.0 mL/min, and the column temperature was set at 30℃. The detection wavelength was 254 nm. EDDS, fumaric acid, citric acid, malic acid and ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) were separated from one another within 8 min. EDDS showed good linearity in the range of 0.06-0.6 g/L. About 0.25 g/L EDDS was detected in the biosynthesis reaction solution catalyzed by recombinant EDDS-lyase, while 36.56 g/L malic acid was formed as the by-product from fumaric acid. The catalytic activity of the enzyme was confirmed in the hydrolysis of 10 g/L EDDS, which produced 3.05 g/L malic acid in 3 h. This analytical method is simple, rapid, sensitive, reliable, and suitable for the analysis in the research of EDDS bioconversion process.
Key words: high performance liquid chromatography (HPLC)     reversed-phase ion pair chromatography     bioconversion     chelating agent     N, N'-ethylenediamine disuccinic acid (EDDS)    

乙二胺二琥珀酸(N, N′-ethylenediamine disuccinic acid, EDDS)是一种天然生物源氨基多羧酸类螯合剂, 主要用于化妆品、洗涤剂, 以及环保行业如重金属污染土壤的修复等。与乙二胺四乙酸(EDTA)相比, EDDS具有更高的pH耐受性和更好的生物可降解性, 是当前土壤修复研究中新一代生物螯合剂[1-4]。EDDS可以采用化学法、发酵法、生物转化法进行生产[5], 其中生物转化法具有较好的环境兼容性, 是国内外重点研发的方法。在生物转化法中, EDDS裂合酶催化富马酸与乙二胺, 从而合成EDDS; 反应过程中富马酸也较容易形成副产物苹果酸(见图 1)。

图 1 EDDS的生物转化 Fig. 1 Biosynthesis of N, N′-ethylenediamine disuccinic acid (EDDS)

EDDS的快速分析是其当前研究、生产和应用的一项重要任务。EDDS的检测方法主要有钙螯合值法、比色法、离子色谱-电感耦合等离子体-质谱法、气相色谱法(GC)和高效液相色谱法(HPLC)[6-8]。土壤修复中EDDS的检测常用到离子交换色谱法和反相HPLC[6, 9-11], 其中反相HPLC检测中, EDDS与流动相中的铜盐形成EDDS-Cu络合物, 在254 nm处有较强吸收。EDDS生物转化过程的监测, 则要求能同时测定原料富马酸、产物EDDS、副产物苹果酸, 检测过程应简单快速, 并且最好能同时鉴别类似物如EDTA等物质, 这也对检测方法提出了更高的要求。富马酸、苹果酸等有机酸的常规检测中, 离子色谱法是常用的方法[12, 13]。在EDDS生物合成研究中, Poddar等[14]采用核磁共振鉴定生成EDDS, 并通过测定反应液在240 nm处紫外吸收的下降来判断转化过程中原料富马酸的浓度变化。Witschel等[15]利用反相离子对色谱法测定反应生成的EDDS, 并利用离子排阻色谱法检测反应过程中苹果酸和富马酸的浓度。更多的报道[16, 17]则是利用四丁基氢氧化铵作为反相离子对试剂, HPLC同时检测反应过程中富马酸和EDDS。Kato等[18]利用C8柱, 同时测定富马酸、L-苹果酸和EDDS。

鉴于C18柱更广泛的应用[19], 建立基于C18柱能同时分析富马酸、L-苹果酸、EDDS的HPLC方法, 并能同时测定产物的类似物EDTA及苹果酸进入三羧酸循环后的典型代谢物柠檬酸的方法, 将有利于EDDS生物合成研究的深入开展。

1 实验部分
1.1 仪器、试剂与材料

Micromass Quattro Micro API液相色谱-三重四极杆质谱仪(美国Waters公司); LC3000型HPLC系统(北京创新通恒科技有限公司), 包括P3000高压输液泵、UV3000紫外可见波长检测、RPL-D2000型柱温箱; UV-3300分光光度计(上海美谱达仪器有限公司); FA2004B十万分之一电子天平(上海精密科学仪器有限公司)。

甲醇为色谱纯, 由美国Fisher公司提供; 富马酸、L-苹果酸、磷酸、25%(质量分数)四丁基氢氧化铵、乙酸铜为分析纯, 购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司; EDDS对照品由台州市博纳化工有限公司提供, 含量为98.0%(质量分数)。

表达EDDS裂合酶的基因工程菌来自本实验室。该酶的GenBank登录号为ABG61966, 是一种精氨琥珀酸裂合酶[14, 20]。

1.2 实验条件
1.2.1 标准溶液的配制

称取乙二胺二琥珀酸三钠盐固体粉末305.2 mg, 加入约30 mL超纯水, 超声5 min, 用10 mol/L的氢氧化钠溶液滴加并调节溶液的pH值至8.5, 使EDDS溶解澄清, 以去离子水定容至100 mL, 得到EDDS标准储备液。

称取富马酸固体粉末300 mg, 加入约30 mL超纯水, 超声5 min, 用10 mol/L氢氧化钠溶液滴加并调节溶液的pH值至8.5, 使富马酸溶解澄清, 以去离子水定容至100 mL, 得到富马酸标准储备液。

1.2.2 供试品溶液制备

EDDS的生物合成反应:在500 mL锥形瓶中加入富马酸11.6 g、乙二胺盐酸盐6.7 g、氢氧化镁2.9 g, 以及去离子水50 mL、工程菌菌体5.0 g, 用10 mol/L氢氧化钠溶液滴加调节溶液pH至8.8, 用去离子水定容至100 mL。于30 ℃以200 r/min条件在摇瓶中进行反应。取反应7 d的反应液作为样品1;加入10 g/L的EDDS对照品于样品1中, 作为样品2。

EDDS的水解反应:在500 mL锥形瓶中加入去离子水50 mL、EDDS 1.0 g, 用10 mol/L氢氧化钠溶液滴加调节溶液至pH≈8.5, 再加入工程菌菌体5.0 g, 继续以10 mol/L氢氧化钠溶液调节溶液pH至8.5, 并以去离子水定容至100 mL。于30 ℃以200 r/min条件在摇瓶中进行反应, 3 h后取样作为样品3。

1.2.3 样品处理

移取样品1、2和3各1.0 mL, 加入3 mol/L盐酸200 μL终止反应, 于5 min后加入3 mol/L NaOH溶液调节pH值至7.0~9.0, 再用去离子水定容至20 mL, 继续用去离子水稀释至适当浓度后, 移取1.0 mL溶液, 以10 000 r/min离心2 min, 上清液待HPLC分析。

1.2.4 色谱条件

色谱柱为InertSustain AQ-C18色谱柱(250 mm×4.6 mm, 5 μm, 日本岛津公司); 柱温为30 ℃; 流动相为25%(体积分数)甲醇水溶液(含1.0 g/L一水乙酸铜、2.0 g/L四丁基氢氧化铵, 以磷酸调节pH值至2.80);流速为1.0 mL/min; 进样量为20 μL; 检测波长为254 nm。

1.2.5 质谱条件

离子源为电喷雾电离(ESI-)源; 离子源温度为100 ℃; 脱溶剂温度为300 ℃; 毛细管电压为3 200 V; 锥孔电压为20 V; 气帘气为氮气, 流量为52 L/h; 脱溶剂气为氮气, 流量为650 L/h; 检测方式为全扫描, 扫描范围为m/z 20~800;进样方式为蠕动泵直接进样。

2 结果与讨论
2.1 色谱条件的选择
2.1.1 检测波长的选择

在190~700 nm波段对0.5 g/L的EDDS溶液进行扫描, EDDS在195 nm处有最大吸收峰, 而在250 nm之后则基本无吸收。在溶液中加入1 g/L的一水乙酸铜后再次扫描, EDDS-Cu复合物在190~285 nm处均有较高的吸收, 并于320 nm左右降至接近基线。与EDDS不同, 富马酸的紫外吸收受乙酸铜的影响相对较小, 其富马酸-Cu复合物与EDDS-Cu复合物的扫描曲线基本重叠(见图 2)。实验选择254 nm作为HPLC的检测波长, 既保证了EDDS-Cu复合物有较高的紫外吸收, 又可以避开游离EDDS对检测的干扰。

图 2 乙二胺二琥珀酸、富马酸及其铜复合物的光吸收曲线 Fig. 2 Absorbance curves of N, N′-ethylenediamine disuccinic acid, fumaric acid and their complex with copper salts
2.1.2 流动相中甲醇体积分数的选择

为开发一个快速简便的HPLC方法, 比较了流动相中甲醇的体积分数对出峰时间的影响(见图 3)。甲醇体积分数为15%时, EDDS、富马酸和EDTA的出峰时间分别为7.5、10.1和11.8 min; 甲醇体积分数为35%和50%时, EDDS和富马酸的出峰时间虽然大为缩短, 但EDTA出峰次序提前, 且EDDS与苹果酸、柠檬酸及EDTA不能有效分离, 不利于副产物和其他杂质的分离检测; 甲醇体积分数为25%时, EDDS、富马酸及苹果酸、柠檬酸和EDTA可基线分离, 峰形均较对称，其出峰时间分别为3.3、3.7、4.2、5.2和6.1 min, 总出峰时间在8 min以内, 且在254 nm处均有较为适中的光吸收, 较有利于样品的快速检测。

图 3 流动相中甲醇体积分数对HPLC分析的影响 Fig. 3 Effect of volume fractions of methanol in the mobile phases on HPLC analysis 1. malic acid; 2. citric acid; 3. EDDS; 4. ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA); 5. fumaric acid.
2.1.3 方法的适用性

EDDS、富马酸及苹果酸、柠檬酸和EDTA这5种物质的快速分离使得本方法适用于EDDS的多个研究领域。比如在EDDS的生物转化和发酵法生产过程中, 除了原料富马酸、产物EDDS外, 富马酸在微生物富马酸酶的催化下会产生副产物苹果酸(见图 1), 苹果酸和富马酸进入三羧酸循环后容易产生柠檬酸, 因而本方法可以用于生物转化和发酵法生产EDDS的检测; 在工艺过程中混入EDTA还会影响EDDS的产品质量, 在土壤修复的研究中需要对比EDTA和EDDS等不同螯合剂的效果, 本方法也能有效区分EDDS和EDTA。

2.2 方法线性范围、检出限、精密度及回收率
2.2.1 线性范围和检出限

精密吸取EDDS和富马酸标准储备液, 用去离子水稀释成0~3 g/L的系列标准工作液, 进行HPLC分析。EDDS和富马酸的质量浓度与峰面积的关系见图 4。

图 4 EDDS与富马酸的质量浓度-峰面积关系曲线 Fig. 4 Mass concentration-peak area curves of EDDS and fumaric acid

从图 4可见, EDDS在含量较低时峰面积与质量浓度之间的线性关系较为明显, 随着质量浓度的升高, 其线性关系降低。EDDS在0.06~0.6 g/L范围内呈现较好的线性关系, 以峰面积为纵坐标(Y)、质量浓度为横坐标(X, g/L)绘制标准曲线, 其回归方程为Y=11 583.0X+123.1, 相关系数(r)为0.999 5。

样品中EDDS最大允许质量浓度可以根据流动相中铜离子的质量浓度进行估算。在254 nm处, EDDS基本没有光吸收, 峰面积主要由EDDS-Cu复合物引起。本文中流动相铜离子浓度为0.5 mmol/L, 铜离子与EDDS等物质的量形成复合物, 则相应色谱峰中EDDS最高浓度也是0.5 mmol/L。在甲醇体积分数为25%的流动相中, EDDS峰洗脱液体积为400 μL, HPLC进样体积为20 μL, 将EDDS峰形近似作为三角形进行估算, 则可计算得到样品中EDDS的最大允许质量浓度为1.791 g/L。即样品中EDDS质量浓度超过1.791 g/L时将导致HPLC流动相中无足够铜离子与EDDS形成复合物。这与本实验结果基本吻合, 当EDDS质量浓度高于1.8 g/L, HPLC的峰面积增长已趋于非常缓慢的状态(见图 4)。

与EDDS不同, 富马酸在反相柱上的分离并不依赖铜复合物的形成, 铜离子的存在不影响富马酸的紫外吸收。在0.06~1.8 g/L范围内, 富马酸的质量浓度与峰面积具有较好的线性关系, 其回归方程为Y=5 013.6X+28.9, r为0.999 5。

通过逐步稀释标准溶液, 获得EDDS和富马酸的检出限(S/N=3), 分别为0.98 mg/L和1.32 mg/L。

2.2.2 精密度和稳定性

对0.6 g/L的富马酸和EDDS样品进行分析, 各连续进样6次, 记录峰面积, 计算得富马酸和EDDS峰面积的RSD分别为0.85%和1.12%(n=6), 表明仪器精密度良好。

取样品2进行稀释, 分别于0、2、4、6、8、10 h进样测定, 记录峰面积, 计算得到EDDS和富马酸峰面积的RSD分别为0.41%和1.73%(n=6)。结果表明, 供试品溶液在10 h内稳定。当供试品溶液继续放置20 h和24 h时, EDDS和富马酸峰面积的RSD分别为0.70%和3.48%(n=8), 说明EDDS依然相对稳定, 而富马酸则相对变化较大。

2.2.3 回收率

在未添加工程菌的EDDS合成反应液中加入EDDS和富马酸标准品, 测定并配制成质量浓度均为5 g/L的EDDS和富马酸混合溶液。取该溶液18份, 每份精密量取1.0 mL, 分为3组, 每组按低、中、高水平分别精密加入相当于3.92、4.90、5.88 g/L的EDDS或富马酸标准品, 测定并计算回收率(见表 1)。结果表明该方法准确性良好。

表 1 EDDS和富马酸在3个水平下的加标回收率(n=9) Table 1 Spiked recoveries of EDDS and fumaric acid at three levels (n=9)
2.3 EDDS生物合成和水解反应样品的测定

按照1.2.2和1.2.3节方法制备供试品溶液并处理样品, 按1.2.4节色谱条件对样品1进行测定。结果表明, 富马酸残留为7.22 g/L, 但产物EDDS含量仅为0.25 g/L, 副产物苹果酸达到了36.56 g/L。将该样品进行质谱分析, 质谱图中m/z为133的信号较高, 进一步证实该副产物为苹果酸(见图 5)。

图 5 EDDS生物合成样品的色谱图和质谱图 Fig. 5 Chromatogram and MS spectrum of the EDDS biosynthesis sample

上述HPLC测定结果表明, 该基因工程中的EDDS裂合酶催化EDDS合成活性较低。由于该酶催化的反应为可逆反应, 为验证该基因工程菌表达的酶是否有活性, 重新设计了以EDDS为底物的水解反应。以10 g/L EDDS为底物, 经过工程菌水解3 h, 得到样品3, 并进行测定, 测得苹果酸、EDDS的含量分别为3.05 g/L和6.76 g/L, 未能检测到典型的富马酸峰。由于EDDS需要先在EDDS裂合酶催化下形成富马酸, 再在富马酸酶作用下形成苹果酸(见图 1), 因而推测该基因工程菌表达的EDDS裂合酶具有催化活性, 同时该工程菌宿主菌中具有较高的富马酸酶活性。

3 结论

本文建立的反相离子对色谱法可以快速同时分离苹果酸、柠檬酸、EDDS、EDTA和富马酸, 为EDDS生物合成机理和工艺开发提供了有效的分析技术支持。

致谢 本文的质谱分析得到普济生物科技(台州)有限公司徐刚博士的支持。
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