双酚A(BPA)是生产聚碳酸酯塑料和环氧树脂的中间体[1], 早期被广泛用于制作塑料水杯、餐具、婴儿奶嘴、饮料及奶粉罐的内衬。研究表明, 双酚A是一种内分泌干扰物质, 会从食品塑料包装材料迁移到食品中, 并被人体吸收[2]。因此, 加拿大、欧盟和美国已禁止在婴儿水杯中使用BPA[3]。随后, 一系列双酚类物质(BPs)出现并应用于塑料工业, 如双酚B(BPB)、四甲基双酚A(TMBPA)、双酚C(BPC)、双酚P(BPP)、双酚Z(BPZ)、双酚芴(BPFL)、双酚AF(BPAF)和双酚AP(BPAP)等[4-7]。该类物质的结构和性质与双酚A类似, 具有慢性毒性、基因毒性及雌激素样活性[8, 9]，但目前对其研究甚少[10, 11]。迄今尚未见同时检测以上9种双酚类物质的相关报道。
国家标准GB/T 5009.156-2016规定, 通过浸出实验可实现水杯中双酚类物质的检测。使用大体积模拟样品对双酚类物质浸出后, 需进行富集浓缩才可进行后续分析。用于BPs富集的传统前处理方法主要有液液萃取法[12]和固相萃取法[13], 但这些方法有机溶剂消耗量大, 易造成环境污染。随后, 一些微萃取技术, 如固相微萃取[14]、分散液液微萃取[15]和超分子溶剂微萃取[16-18]被用于检测双酚A, 以实现仪器微型化和实验绿色化。但这些实验器材多为塑料材质, 其中含有的双酚类物质会严重干扰低浓度水平下双酚类物质检测的准确性[19]。高度自动化的在线富集前处理技术, 可将样品富集后直接分离检测, 可简化实验步骤, 缩短分析周期; 避免样品污染, 减少实验误差; 降低样品损失, 提高分析灵敏度。
本文以塑料儿童水杯浸出液中可能含有的9种双酚类物质作为分析对象, 建立了自动在线富集与高效液相色谱-荧光检测(online enrichment-HPLC-FLD)的方法, 以简化复杂的样品前处理流程, 如水体富集和净化步骤, 且使用荧光检测器即可获得与质谱法检测相近的灵敏度[20], 使水体中新型BPs的实时监测成为可能。
Thermo Fisher Ultimate TM3000高效液相色谱仪, 配有DGP-3600RS双三元泵、带六通阀的TCC-3000柱温箱、FLD-3400RS荧光检测器和Chromeleon 7.10工作站(赛默飞世尔科技有限公司, 美国); KH-700DE型数控超声波清洗器(禾创超声仪器有限公司, 中国); MS-105DU电子分析天平(梅特勒托利多, 瑞士)。
BPA(纯度＞99%)、BPZ(纯度＞98%)、BPFL(纯度＞98%)、BPAP(纯度＞99%)购自上海麦克林生物化学试剂有限公司; BPB(纯度＞95%)购自美国Ark Pharm公司; BPAF(纯度＞99%)购自北京百灵威科技; BPP(纯度＞98%)和BPC(纯度＞98%)购自日本Tokyo Chemical Industry公司; TMBPA(纯度＞98%)购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。甲醇购自德国默克公司(达姆施塔特); 娃哈哈纯净水购自杭州娃哈哈集团。
精密称定9种双酚类物质各0.01 g, 分别置于10 mL容量瓶中, 用甲醇定容, 得1 g/L各对照品储备液; 分别准确量取各对照品储备液适量, 置于50 mL容量瓶中, 用5%(v/v)甲醇水溶液定容, 得混合对照品储备液(BHFL为0.1 g/L, BPA和BPB为0.1 mg/L, 其他物质均为1.0 mg/L)。各对照品储备液和混合对照品储备液均在4 ℃下储存。
移取混合对照品储备液，逐级稀释, 得BPA和BPB质量浓度为0.4、2.0、4.0、10.0、20.0、40.0和80.0 ng/L, BPFL质量浓度为0.2、0.4、2.0、4.0、10.0、20.0、40.0和80.0 μg/L, 其他双酚类物质的质量浓度为2.0、4.0、20.0、40.0、100.0、200.0、400.0和800.0 ng/L的系列工作溶液，现用现配。
以不含BPs的去离子水作为空白溶剂配制实验用溶液, 且实验过程中均使用玻璃器皿, 以避免BPs从塑料实验器皿中浸出, 影响检测结果的准确度[20]。
购买10个聚碳酸酯儿童水杯, 分别标注为1~10号, 于25 ℃烘箱中干燥至恒重(每隔3 h称重一次, 以连续两次干燥的重量差异在各水杯质量的万分之三以内为恒重), 测定水杯的高度(测定高度的上缘至水杯上边缘的距离不超过1 cm)和平均直径, 估算其接触面积。根据GB/T 5009.156-2016规定, 按接触面积以1.5 mL/cm2取相应体积的100 ℃热水倾入杯中, 盖上表面皿, 置于100 ℃烘箱中恒温4 h, 避光冷却至室温后即为水杯浸出液。
取5 mL浸出液进样分析, 以各物质的保留时间(tR)作为检定物质的依据, tR偏差在2.5%范围内可视为同一物质, 并根据标准曲线计算各水杯浸出液中双酚类物质的含量。剩余溶液转移至玻璃锥形瓶中, 储存于4 ℃冰箱中, 当水样中双酚类物质含量超出线性范围时, 取剩余浸出液稀释至符合线性范围, 再进样分析。
在线富集分析系统示意图见图 1, 六通阀切换条件为0~7.0 min时, 六通阀为1-6位; 7.0~9.8 min时, 六通阀切换至5-6位; 9.8~24.0 min时, 六通阀切换回1-6位。
高效液相色谱-荧光检测条件:分析柱为Sunfire C18色谱柱(250 mm×4.6 mm, 5 μm, 沃特世科技有限公司, 美国); 富集柱为Kromosil C18色谱柱(150 mm×4.6 mm, 5 μm, 汉邦科技有限公司, 中国); 柱温为30 ℃; 流动相为(A)甲醇和(B)水; 流速为0.9 mL/min; 进样量为5 mL。采用的荧光激发波长与发射波长(λEx/λEm)为BPFL 230/319 nm, PA、BPB、BPAF、BPAP、BPC、BPZ、BPP和TMBPA 228/306 nm。梯度洗脱程序见表 1。
9种双酚类物质的最佳激发波长与发射波长(λEx/λEm)见表 2。若设定9个最佳λEx/λEm同时采集, 则基线噪音增大, 导致各物质的检测灵敏度降低。如表 2所示, 9种物质的最佳λEx/λEm相近, 故选用9种双酚类物质的平均λEx/λEm采集荧光信号。结果表明, BPFL在此条件下响应信号强度明显降低。因此, 设置BPFL的最佳λEx/λEm(230/319 nm)采集其荧光信号, 而对BPA、BPB、BPAF、BPAP、BPC、BPZ、BPP和TMBPA则采用平均λEx/λEm(228/306 nm)采集其荧光信号。
参照文献[21], 本实验首先固定富集流动相为甲醇-水(5:95, v/v), 富集时间为5 min。在此条件下进行洗脱与分离条件的优化。为减小峰展宽, 缩短分析时间, 同时避免富集柱上的强保留杂质被洗脱至分析柱上, 在保证所有目标物完全转移至分析柱的前提下, 反冲时间应尽可能短。设Vf=tf×F、Vc=π×r2×L, 其中，Vf和Vc分别为反冲体积和富集柱体积(mL)、tf为反冲时间(min)、F为流动相体积流速(mL/min)、r为色谱柱内径(cm), L为色谱柱长(cm)。当Vf≥Vc时, 可使目标物转移至分析柱; 当Vf=Vc时, 得最短反冲时间为2.8 min。
实验考察了乙腈-水和甲醇-水体系对9种双酚类物质的洗脱和分离能力, 并优化洗脱和分离的流动相条件。结果表明, 当洗脱流动相为甲醇-水, 且以表 1中右泵梯度程序洗脱时, 各目标分析物可实现基线分离。
实验同样对富集过程中的富集流动相比例以及富集时间进行了优化。考虑本实验需除去水溶性杂质, 保留疏水性较高(lg Kow＞3.295[22])的双酚类物质, 因此以甲醇-水(5:95, v/v)作为富集流动相, 以0.9 mL/min的流速将样品带入在线富集柱, 淋洗杂质并富集待测物, 以减少待测组分的损失, 提高结果的准确度。同时, 采用与富集流动相组成相同的5%(v/v)甲醇水溶液溶解样品, 以减少大体积进样(5 mL)产生的溶剂效应对富集效果的影响。
实验对富集时间进行了优化(见图 2)。结果表明, 在2~7 min时, 富集效率随着富集时间增加而增加; 7 min后, BPAP、BPC、BPFL及BPP的富集效率随富集时间的增加而减小, 可能原因是这些双酚类物质疏水性相对较弱, 用高水相比例的富集流动相长时间淋洗后, 导致部分样品被洗脱; 当富集时间增至8.3 min时, TMBPA在HPLC系统内的保留时间大大增加(＞25 min), 使分析周期延长, 降低分析效率。因此, 实验选择7 min作为富集时间。
以优化后的富集、洗脱和分离条件对9种双酚类物质进行在线富集分析检测, 结果见图 3, 各物质间均达到基线分离, 在激发/发射波长为228/306 nm和230/319 nm时，基质中的杂质对分析结果均无影响, 分离效果良好。
按欧盟非强制执行法案2002/657/EC, 考察所建分析方法的专属性、线性范围、准确度、精密度、稳定性、检出限(LOD)和定量限(LOQ)。
在建立的色谱条件下, 各物质的分离度为1.20~4.46, 杂质峰与待测物质峰间亦可达基线分离(1.77~2.04), 说明该方法专属性良好。
取每日配制的标准工作溶液, 以各待测物的色谱峰面积对质量浓度绘制标准曲线, 线性回归方程和相关系数(r2)见表 3。9种双酚类物质在各自范围内均呈良好的线性关系, 相关系数均大于0.998, 符合含量测定要求。以3倍和10倍信噪比(S/N)对应的双酚类物质的质量浓度作为方法检出限和定量限, 得各双酚类物质的LOD与LOQ见表 3。
分别移取2、20、40 ng/L BPA和BPB, 2、20、40 μg/L BPFL及20、200、400 ng/L BPAF、BPAP、BPC、BPZ、BPP和TMBPA低、中、高3个水平的样品3份, 于3 d内每天进样6针, 以峰面积的值计算相对标准偏差(n=6), 考察日内及日间精密度(见表 4)。结果表明, 日内精密度为0.4%~9.6%;日间精密度为0.5%~10.2%。
取上述低、中、高3份样品各5 mL, 向其中分别加入0.5、1.0和2.0倍水平的标准工作溶液5 mL, 每个加标水平样品平行6份, 分别测定并计算回收率和相对标准偏差, 结果见表 4。9种双酚类物质的加标回收率为90.7%~112.4%, RSD为0.9~11.3%, 表明该方法的精密度和准确度均符合含量测定要求。
将新鲜配制的中等水平对照品溶液分成两份, 分别于4 ℃和25 ℃条件下储存, 自配制时刻起于0、12、24、48和72 h进样测定, 计算峰面积的RSD, 并用12、24、48和72 h时物质的峰面积与0 h时的峰面积(计为100%)比较, 以表征物质的降解趋势(见图 4)。在低温条件下(4 ℃), 72 h内9种双酚类物质峰面积的RSD为0.4%~10.4%, 表明这9种物质在低温状态下性质稳定; 而当温度升至25 ℃时, BPA、BPB、BPAF、BPAP、BPC、BPFL、BPZ和TMBPA的峰面积于72 h后明显降低(＞10%), 说明常温下9种双酚类物质的稳定性降低。因此, 所有工作溶液需当天配制使用, 并于4 ℃冰箱内储存。
采用所建方法检测儿童水杯浸出液中9种双酚类物质的含量(见表 5)。计算公式为双酚含量=n×c×Δm/(m0×ρ), 其中, n为稀释倍数, c为计算的待测物含量(ng/L), m0为儿童水杯的质量(g), Δm为浸出液的质量(g), ρ为水的密度(g/cm3)。结果表明, 90%的水杯有较高含量的BPA(＞0.6 mg/kg, 欧盟条例2004/19/EC规定, 双酚A的迁移量不得超过0.6 mg/kg); BPB、BPC、BPAF和TMBPA等双酚类物质的检出率分别为30%、50%、30%和20%(检出量＞LOQ的水杯数占总水杯数的比例), 其检出量远低于BPA的检出量, 表明目前塑料儿童水杯中的双酚类化合物仍以BPA为主。因此本文所建方法不仅可以有效监测水样中多种双酚类物质, 也可用以评估和监控BPA替代品的使用趋势。此外, 由于BPFL的荧光吸收较弱, 本法对BPFL的检测灵敏度(LOQ为200 ng/L)低于其他8种物质, 在本文中未有检出, 因此后续研究将结合更有效的前处理方法或分析方法，以进一步提高BPFL的检测灵敏度。
为模拟实际生活中儿童水杯循环使用的情况, 按1.3节方法重复处理1号、7号、9号和10号水杯各5次, 每次取100 ℃下恒温4 h的浸出液分析, 以峰面积与浸出液质量的比值表征单位质量浸出液中双酚类物质的含量, 考察儿童水杯的循环使用次数对其中双酚类物质浸出量的影响(见图 5)。结果表明, 各物质的浸出量整体呈先上升后下降的趋势, 在第2~4次处理时(在100 ℃条件下累计维持4~16 h), 浸出量达到最高, 在第5次处理时(在100 ℃条件下累计维持20 h), 绝大多数双酚类物质的浸出量约降为新水杯中双酚类物质浸出量的1.0~1.5倍, 表明新水杯使用数次后会释放出大量双酚类物质, 随着使用次数增加, 水杯中双酚类物质浸出量虽然下降, 但仍会不断释放。随着浸出时间增加, BPA浸出量下降趋势最显著, 这可能与BPA在高温时不稳定有关(见图 4); 而BPC在1号、7号和9号水杯中的浸出量均基本不变, 说明该物质在水杯使用过程中稳定而持续释放, 这与其在稳定性实验中表现出的良好稳定性一致(见图 4, 25 ℃下72 h内基本不降解)。该结果表明, 作为BPA替代物出现的各类BPs, 如BPC、BPP和BPAF等, 因其良好的化学稳定性, 反而不易降解, 更易随水杯的使用持续不断释放并迁移。
本文采用在线富集与高效液相色谱-荧光检测联用技术, 建立了简便、高效、准确测定水中9种双酚类物质的方法。本方法优化了在线富集和分析过程, 实现了样品的在线富集和除杂, 避免了繁琐的样品前处理过程, 大大节约了实验时间和成本, 且重复性好, 准确度高, 适用于水中痕量双酚类物质的检测。将此法用于检测我国市售儿童水杯的浸出液中9种双酚类物质, 发现作为BPA替代物出现的新型BPs, 因稳定性较BPA高, 不易降解, 更易随着水杯的使用持续不断释放并迁移, 故使用本文所建方法同时快速监测这些双酚类物质具有重要意义。
2019,
Vol. 37 Issue (11): 1185-1192 DOI: 10.3724/SP.J.1123.2019.04016 
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2019,
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