色谱  2019, Vol. 37 Issue (11): 1209-1214     DOI: 10.3724/SP.J.1123.2019.04020   PDF    
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田春杰
陈明鑫
王丹琦
王宏玲
关建环
张梦婷
孙国祥
计算机辅助一清片径向展开薄层色谱定性与定量方法初探
田春杰, 陈明鑫, 王丹琦, 王宏玲, 关建环, 张梦婷, 孙国祥     
沈阳药科大学药学院, 辽宁 沈阳 110016
收稿日期：2019-04-11
基金项目：沈阳药科大学大学生创新创业训练计划项目（201810163002）
通讯联系人：张梦婷.E-mail:zmt20119@163.com; 孙国祥, Tel:(024)24226760, E-mail:gxswmwys@163.com
摘要：径向薄层色谱法（RTLC）是一种将样品呈圆形或环状点样，然后将展开剂从中心向外沿径向输送的薄层色谱方法。在一定的展开距离内，RTLC是一种分离快速、扩散小、不拖尾的高效分离和半制备方法。目前关于RTLC分离的报道较多，但对RTLC定性和定量的报道较少。该文采用自编程方式结合图像处理软件，实现RTLC图像数字化处理，形成RTLC数字化图谱，并对RTLC进行定性与定量方法学验证，建立了一清片RTLC定性与定量方法。辅助计算机技术，对一清片径向展开薄层色谱定性与定量方法进行初探。结果表明，该方法用于RTLC定性的可靠度较好，但用于RTLC的定量，仍有不足之处，这可能与实验环境条件等有关。通过搭载更好的分离和数据采集设备，RTLC会有适合的用武之地。计算机图像处理和自编程方法的结合给了RTLC和其他一些分析相关的技术广阔的发展前景。相信未来在计算机技术的辅助下，薄层色谱技术会迈上一个新的台阶。
关键词：径向展开薄层色谱    计算机图像    定性与定量方法    一清片    
Primary study on computer-aided qualitative and quantitative radial thin-layer chromatography methods for analysis of Yiqing tablets
TIAN Chunjie, CHEN Mingxin, WANG Danqi, WANG Hongling, GUAN Jianhuan, ZHANG Mengting, SUN Guoxiang     
School of Pharmacy, Shenyang Pharmaceutical University, Shenyang 110016, China
Foundation item: Shenyang Pharmaceutical University Undergraduate Innovation and Entrepreneurship Training Program (No. 201810163002)
Abstract: Radial thin-layer chromatography (RTLC) is a form of chromatography in which the sample and developing agent/solvent are applied at the edge of a circle on the silica-layered TLC plate. The sample components are radially transported from the center of the circle toward the periphery by the solvent flow. RTLC is an efficient separation and semi-preparation method, with the advantages of fast separation, low diffusion, and absence of tailing at a certain distance. Although RTLC isolation has been well documented in the literature, there are only a few qualitative and quantitative reports on this technique. In this study, a self-programming module combined with image processing software was adopted for digital processing of RTLC images, and a digital atlas was created. Qualitative and quantitative verification of RTLC was then conducted. With the aid of computer technology, qualitative and quantitative methods of radially expanded TLC for Yiqing tablets were investigated. The results showed that the qualitative RTLC method has good reliability, but the quantitative RTLC method has inherent drawbacks, which may be associated with the experimental environment. We strongly believe that better separation and data acquisition equipment, as well as the combination of computer image processing and programming methods, will open up infinite possibilities of analysis/separation using RTLC-based techniques. We also believe that TLC will take a new step in the future with the assistance of computer technology.
Key words: radial thin layer chromatography (RTLC)     computer imaging     qualitative and quantitative methods     Yiqing tablets (YQTs)    

普通薄层色谱(thin layer chromatography, TLC)由于流动相的输送方式和色谱系统的不均衡性, 在分离能力、效率和重复性方面还存在一些不足。

径向薄层色谱法(RTLC), 是一种将样品呈圆形或环状点样, 然后将展开剂从中心向外沿径向输送的薄层色谱方法[1]。该法于1950年首次报道[2], 常应用于多肽、氨基酸和重金属的分离[3-5]。由于斑点的形态和展开方向的特殊性, 目前用于分离的报道较多, 对RTLC定性和定量的报道较少。

当前, 普通TLC的定性方法主要有比移值(Rf)定性和相对比移值(Rr)定性法[6]。普通TLC定量的方法有目视比较法[7]、洗脱测定法[8-10]、斑点面积法[11]、薄层扫描法[12, 13]和与其他技术的联用方法[14-18]。其中薄层扫描法是目前使用最多的方法, 也是较为可靠的技术手段之一。

薄层扫描法也称薄层光密度法, 一般采用透射法或反射法测定斑点对光的吸收强度[19]。这两种方法测定的分别是斑点对照射光的吸收情况或反射情况。透射法对薄层厚度及透明度有一定的要求, 但反射法对其要求不高, 因此反射法较为常用。

图像分析仪通常和计算机连接使用, 依赖于计算机辅助图像分析技术, 是将图像信号转换为数字信号并使用计算机对其进行处理的过程[20]。目前, 计算机数字图像描述、特征提取和模式识别在医学领域得到了广泛的应用[21-24]。

一清片(YQTs)由黄连、大黄、黄芩3味药组成, 其功效为清热泻火解毒和化瘀凉血止血, 临床上用于火毒血热所致的大便秘结、咽炎、扁桃体炎、牙龈炎等的治疗[25-27]。在280 nm下, 黄芩中的黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素均显暗绿色; 在335 nm下, 野黄芩苷显暗绿色[28, 29]。在254 nm下, 黄连中的巴马汀和药根碱显黄绿色; 在365 nm下, 药根碱显棕褐色, 小檗碱和巴马汀显黄色荧光[30-32]。大黄在365 nm下出现5个荧光斑点, 均显橘黄色, 分别为芦荟大黄素、大黄素、大黄素甲醚、大黄酚和大黄酸, 通过氨蒸汽熏蒸会呈现橙色斑点[33, 34]。由于酸碱度、时间、显色剂等均能导致药材中有效成分的荧光淬灭[35-37], 所以实验需控制好酸碱度、时间长短以及避开能导致荧光淬灭的显色剂。

本探究旨在通过薄层色谱光密度反射法结合自编程的计算机图像识别技术, 辅助实现一清片径向展开薄层色谱技术定性和定量方法的开发与应用。

1 实验部分
1.1 仪器、材料与分析软件

ZF-C型3用紫外分析仪(上海康禾光电仪器有限公司); 超声波清洗机(广州市吉普超声波电子设备有限公司); ISO 9001电子分析天平(北京赛多利斯天平有限公司)。

10批YQTs(辽宁康博士制药有限公司); 盐酸小檗碱(BH)化学对照品(批号:0713-9605, 供含量测定用)、盐酸药根碱(JH)化学对照品(批号:0733-9605, 供含量测定用)和盐酸巴马汀(PH)化学对照品(批号:0732-9604, 供鉴别用)(中国药品生物制品检定所)。硅胶板(型号:HSGF254, 3色分开, 烟台江友硅胶开发有限公司); 正丁醇(分析纯, 天津市富宇精细化工有限公司); 乙酸乙酯(分析纯, 天津市富宇精细化工有限公司), 冰乙酸(分析纯, 天津恒兴化学试剂股份有限公司), 无水乙醇(分析纯, 天津大茂化学试剂股份有限公司)。

软件:Matlab 9.7, Origin 8.5, Photoshop CS 5。

1.2 溶液配制与展开溶剂系统

YQTs提取物:取1片YQTs, 研细, 取约0.3 g, 精密称定, 加入10 mL 90% (体积分数, 下同)乙醇, 超声30 min, 过滤, 取滤液, 即得。

称取适量的BH、JH和PH对照品, 分别用甲醇配制成0.16 g/L的溶液。

选用正丁醇-乙酸乙酯-冰醋酸-水(7:1:1:1, v/v/v/v)作为溶剂系统, 分离文中的BH、JH、PH对照品和YQTs提取物。

1.3 径向展开装置

使用针头、橡胶塞、玻璃管等自组装简单的RTLC装置(见图 1a)。在展开过程中, 在中心处安装一个带孔的盖子, 可以帮助减少环境因素的影响。具体的测试条件可以根据实际测试灵活变动。图 1b是RTLC的示意图。试验过程中, 用环状工具点出A处所指的环形斑点, 或者用毛细管点出径向斑点, 用输送工具从圆心O处向固定相上输送展开剂, 展开剂沿B处箭头所示各个方向由中心向外展开, 洗脱分离组分。

图 1 径向展开(a)装置和(b)展开方式示意图[38] Fig. 1 Schematic diagram of (a) radial expansion device and (b) expansion mode[38]
1.4 计算机辅助一清片径向展开薄层色谱定性与定量方法的建立

使用相机在紫外灯下采集数字图像后, 对图像进行了一系列处理, 具体操作流程见图 2。采用Photoshop CS 5对图片进行方形裁剪(尺寸可调, 一般4 cm×4 cm), 调整图片分辨率(数值可调, 一般800 DPI)。将调整好的图片导入到Origin 8.5中, 将数字图片转换为数字矩阵, 矩阵横纵坐标对应的是原图片每个像素点的位置, 数值对应原图片上各个像素点的灰度值(范围0~255)。将数字矩阵导入到Matlab 9.7中, 进行灰度值积分:以矩阵中心为原点, 以1个像素点长度为步长, 设定偏移量为±0.5个像素点, 对在同一步长范围的各个像素点的灰度值进行积分处理(步长和灰度值可调)。数据拟合:以半径为横坐标, 各半径对应的灰度值积分为纵坐标, 绘制拟合曲线, 进行预评价, 寻找溶剂前沿对应的半径值, 并通过横坐标的缩放变换, 将溶剂前沿数值固定(数值可调, 设为1最佳, 此时横坐标即为比移值), 即可得到RTLC数字化图谱, 将数据文件导出。数字化图谱后续的峰积分及其他特征参数提取在Origin软件上完成。

图 2 径向薄层色谱定性和定量方法流程图 Fig. 2 Flow chart of qualitative and quantitative methods for radial thin layer chromatography

上述的RTLC数字化图谱中各峰顶点的横坐标即代表各组分的比移值, 可直接用于定性。各峰面积经过定量方法学验证合格后, 即可以用于一清片中组分的含量测定。

2 结果与讨论
2.1 专属性

将YQTs提取物和BH、JH、PH对照品各点样3 μL, 按照1.2、1.3节中方法展开后, 照1.4节中方法进行数据处理。可确定峰1为JH, 比移值0.27；峰2为PH, 比移值0.38；峰3为BH, 比移值0.47；样品中组分比移值与对照品中该成分差异在±0.04以内(见图 3)。结果表明, 方法的专属性良好, 可用于RTLC定性。

图 3 数字化后的RTLC(a)数字图像和(b)数字色谱图 Fig. 3 (a) Digital image and (b) digital chromatograms of RTLC after digitization Peaks: 1. jateorhizine (JH); 2. palmatine hydrochloride (PH); 3. berberine hydrochloride (BH).
2.2 定量方法及其验证
2.2.1 精密度

同一份YQT样品, 连续点样6次, 每次3 μL, 展开后数据处理, 以BH斑点面积计算RSD。RSD值为5.47%, 本方法精密度可满足薄层色谱技术要求。

2.2.2 回收率

配制7份样品, 其中6份加入160 μg/mL的BH对照品溶液, 混合均匀后, 作为加样待测液。一份与纯甲醇按1:1(v/v)混合, 作为阴性液。每份样品分别点样2次, 每次3 μL, 展开后数据处理, 根据外标一点法计算BH的回收率范围及其RSD。其回收率范围为92.5%~102.9%, RSD为4.08%。表明该方法的准确度符合薄层色谱技术要求, 可用于RTLC定量。

2.3 对照品线性

分别精密吸取对照品溶液(160 mg/L) 2、4、6、8和10 μL进行展开, 记录色谱图。分别以BH对照品质量(X, ng)为横坐标、峰面积(Y)为纵坐标绘制标准曲线图。BH的线性回归方程为:Y=0.123 8X+14.204(相关系数r=0.944 6)。结果表明:BH在60.5~960 ng范围内时, 可以使用峰面积来对YQTs中的BH进行含量测定。

2.4 样品测定

10批YQTs样品和外标样品(ES, 160 mg/L)分别点样2次, 每次3 μL, 展开后数据处理, 记录色谱图。计算比移值进行定性, 根据外标一点法计算YQTs中BH的含量, 结果见表 1。10批YQTs中, 小檗碱的含量范围在2.38~3.65 mg/片之间, 质量差异较小。

表 1 RTLC法测定YQTs中BH的定性和定量结果 Table 1 Qualitative and quantitative results of BH in YQTs determined by RTLC
2.5 计算机辅助RTLC定性与定量方法讨论

在计算机辅助RTLC定性与定量方法中, 有一些技术要点:(1)图片裁剪为方形, 只是为了矩阵计算方便, 将一个完整的展开裁入即可, 并没有其他严格要求。对图片进行固定大小的裁剪并调整分辨率是为了校正不同拍摄角度和不同拍摄距离导致的误差。(2)分辨率、步长设置可以决定最后数字化的精度, 与检测器的数字采集密度是对应的。分辨率高, 步长小, 则数据采集密度大。数据采集密度理论上越大越好, 这样可以保证采集信息的完整性和丰富度。但是实际上不宜过高, 因为采集过多的数据会给计算机的存储和运算带来负担, 降低运算速度, 同时可能增大噪声。本研究中, 设定的图片大小为4 cm×4 cm, 分辨率为800 DPI, 整张图片的数据量为1 260×1 260个, 使用的计算机为全新自组装台式机(CPU: Intel Core i5-8400 CPU@2.80GHz; 主板:华硕PRIME Z370-P; 内存:威刚8.00 GB (2400 MHz); 主硬盘:250 GB (西数WDC WDS250G2 B0A-00SM50))。在计算机存储和运行性能良好的情况下, 运算时间大约为2分钟。一般笔记本基本无法运行, 强行运行速度缓慢甚至导致电脑死机或蓝屏。(3)矩阵中心要尽可能准, 这样才能尽量保证数字化的真实性和准确性。(4)坐标变换时, 溶剂前沿的固定数值是可调的, 但在同一个实验或进行同一批分析时应保证所有图像处理时设定的溶剂前沿是相同的。这样可以避免因分辨率、步长设置、图像采集时相机与板间距离不固定, 以及图片裁剪大小不一致等造成数据失真和处理困难, 同时相当于固定量纲, 便于定性和定量计算。(5)不提前进行降噪等处理, 既简化了运算过程, 也尽可能保证了数据的原始性。(6)因图片采集、背景差异等造成的误差全部可以通过合理的背景扣除消除, 而不影响定性和定量的准确性。(7)灰度值积分是指以矩阵中心为原点, 以半径为横坐标, 对与原点距离相同的所有像素点的灰度值进行积分, 这个过程类似于收折扇, 为下一步的径向展开数字化图谱的生成提供数据基础; 由于像素点是一个个点, 是非连续的数据, 而半径是连续数据, 所以只能采用步长加偏移量的方式将在一定距离范围内的像素点全部纳入其中, 既不重复统计像素点, 又不遗漏有效数据点。例如, 当半径是2.5时, 偏移量±0.5的意思是, 将半径距离在2.0~3.0内的像素点灰度值最终统计为一个数值。偏移量设置要与步长匹配, 保证各像素点数据既不会被重复采集, 又不会被遗漏。(8)经数字化处理后, 径向展开的斑点扩散、展开不均匀等问题会在峰宽和分离度上有所体现, 噪点会被均化, 其实相当于自动去噪。(9)本文在进行图片处理时, 没有进行由彩色图片到灰色图片的灰度转换, 每一个像素点都有像素坐标和像素亮度这两个基本组成要素。一般图片的像素坐标特征采用矩阵表示, 彩色图片的亮度值可以采用RGB色彩模式或灰度值表示, 灰度图像的亮度值则只能用灰度值进行表示。彩色图像的灰度值与RGB色彩模式之间存在转换公式:Gray=0.30Red+0.59Green+0.11Blue。Gray指灰度值, Red、Green、Blue是RGB色彩模式中红、绿、蓝3个通道的颜色。本文进行转换的目的是简化处理, 方便积分。当然也可以对Red、Green、Blue单独进行灰度值积分, 结果是否会具有更好的特征性值得进一步探究。

3 结论

本文所采用的方法用于RTLC定性可靠度较好, 在RTLC定量方面尚有欠缺, 这可能与实验环境条件等有关。实验仪器简陋, 手动操作误差大, 数据采集时环境干扰大, 都对实验结果造成了严重影响。在本探究中, RTLC技术有很强的分离效率和潜在的半制备价值, 使用适当的仪器设备有望发挥RTLC的技术优势。计算机图像处理和自编程方法的结合, 给了RTLC和其他一些分析相关的技术广阔的发展前景。薄层色谱技术的发展很难、很慢, 但是这项技术的优势也是无可替代的。相信在未来, 在计算机技术的辅助下, 薄层色谱技术会迈上一个新的台阶。

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