自然界中, 一些植物含有天然有毒成分, 这些有毒成分被食用后会引起植物性食物中毒。最近几年, 食品安全受到广泛关注, 人们崇尚追求“无污染”和“纯天然”的食品, 喜爱采食野生植物, 导致误食有毒植物的中毒事件呈上升趋势, 如黄夹苷A为黄花夹竹桃中的主要有毒成分, 在斯里兰卡常引起中毒^{[1, 2]}, 在我国乌头生物碱类引起的中毒也时有发生^{[3, 4]}。一些天然食品拥护者声称野生蜂蜜比家养蜂蜜具有更高的营养价值, 野蜜蜂博采百花, 若所采花蜜有毒, 酿制的蜂蜜或由此加工制成的蜂蜜食品也是有毒的, 我国多地曾报道过多起食用野蜂蜜中毒事例^[5-7], 花粉有毒的植物有钩吻、曼陀罗、醉鱼草、雷公藤、狼毒、乌头、羊踯躅、博落回、黎芦和七黄耆等^[8]。近几年来保健食品层出不穷, 特别是植物源保健食品显著增加, 被宣传为有治疗糖尿病、高血压、肥胖等多方面的作用, 然而它们存在潜在的健康风险, 给消费者造成严重的健康问题, 如食用了含有马兜铃酸的一些减肥产品, 马兜铃酸具有肾毒性, 已造成100多名比利时妇女出现肾衰竭或尿路上皮细胞癌变^[9]; 此外使用含有麻黄的保健品时, 过量的麻黄生物碱类成分会产生严重的毒副作用, 包括引起中风、癫痫发作, 甚至死亡^[10]。欧洲食品安全局(EFSA)^[11]也日益关注植物性毒素的危害, 已发表了一些关于植物性毒素的科学观点, 并列出了900多种含有有毒、易成瘾、有精神作用或其他有毒有害作用物质的植物名录。

我国植物资源丰富, 其中有毒植物数量较多, 分布范围较广, 植物性食物中毒事件时有发生, 有文献^[12]统计了2004~2013年我国突发公共卫生事件报告管理信息系统报告中的中毒事件, 植物性食物中毒共发生660起, 累计报告中毒17 955人, 死亡196人, 病死率为1.1%, 引起中毒的已知植物分布于19个科31个属, 其中乌头、油桐、蓖麻子、发芽马铃薯、钩吻等引起的事件起数和中毒人数分别占事件总起数和总中毒人数的24.5%和19.1%, 乌头引起的中毒死亡人数最多, 病死率高达15.1%。

当植物性食物中毒事件发生时, 有的临床症状非常有特征, 引起中毒的植物能被追溯, 通过流行病学调查和分析可缩小可能引起中毒的毒物范围, 就可选用针对强的检测方法进行检测。而更多的是一些不明原因的中毒事件, 临床症状无明显特征, 引起中毒的植物不能被明确追溯, 如野蜂蜜中毒、植物源保健食品中的污染或掺假植物中毒等, 对于这些中毒事件的检测非常具有挑战性, 需要一种多毒素同时检测的方法进行检测, 只有快速检测出引起中毒的毒物, 才能指导临床对因治疗, 有效救治患者, 同时也为有关部门采取控制手段提供科学依据, 以防事态进一步扩大。

目前已有多篇文献采用液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)法或液相色谱-轨道阱高分辨质谱(LC-Obitrap MS)法对动物饲料、食品、食物和植物源保健食品中多种有毒植物成分进行检测和筛查^{[13, 14]}, 也有采用超高效液相色谱-高分辨质谱(QTOF)法对引起中毒的食物进行毒物筛查^[15], 还有采用LC-MS/MS法测定血液、尿液、胃液和草药中的有毒生物碱^[16-20]。Gaillard等^[21]综述了可能造成人类中毒的40种有毒植物及其相应的检测方法, 刘亚峰等^[22]对我国常见有毒植物成分的检测方法进行了介绍。

为了达到有毒植物成分多组分快速检测的目的, 本文选择了84种常见有毒植物成分为目标化合物, 采用了超高效液相色谱-三重四极杆/复合线性离子阱质谱联用(UPLC-Qtrap MS)技术, 建立了同时快速测定血浆和尿液中84种有毒植物成分的检测方法。84种有毒植物成分中包括66种生物碱类, 分别属于乌头类、茛菪碱类、阿片类、马铃薯糖苷类、马钱子类、雷公藤类、钩吻类、麻黄类、藜芦类、吡咯里西啶类生物碱, 以及毒芹碱、光盖伞辛、蓖麻碱、相思豆毒素和秋水仙碱; 强心苷类成分有黄夹苷A、夹竹桃苷和苷元; 氰苷类成分有苦杏仁苷和野黑樱苷; 商陆皂苷类成分有商陆皂苷和商陆皂苷元; 黄酮类成分有鱼藤酮; 木脂素类成分有鬼臼毒素; 四环二萜类成分有3种闹羊花毒素; 硝基菲类有机酸类成分有马兜铃酸I和马兜铃酸C。田麦角碱和麦角柯宁碱属麦角类生物碱^[23], 毒黄素是椰毒假单胞菌产生的一种细菌毒素^[24], 以上3种毒素虽不属于有毒植物成分, 但存在于植物中; O-6-单乙酰吗啡为海洛因体内代谢产物, 苯甲酰爱康宁为可卡因体内代谢产物, 为了测定上的方便, 将它们一并纳入本方法中。蓖麻毒蛋白和相思豆毒蛋白为最强烈天然毒素之一, 由于是大分子蛋白质, 测定难度极大, 因此将与它们共存的蓖麻碱和相思豆毒素作为中毒检测的标志物^{[25, 26]}进行检测。本法可以快速检测血浆和尿液中84种有毒植物成分, 检测的毒物数量多, 类别分布广, 且方法简单快速, 灵敏度高, 明显优于文献^[16-20]中报道的方法, 为今后有效应对植物性食物中毒引起的公共卫生突发事件提供可靠的检测方法。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

超高效液相色谱仪由ACQUITY UPLC BSM二元溶剂管理系统、ACQUITY UPLC FTN样品管理系统和ACQUITY UPLC CM-A色谱柱管理系统组成, 由Empower 3工作站控制, Prime HLB SPE柱(60 mg/3 mL)(美国Waters公司); QTRAP 6500三重四极杆/线性离子阱复合质谱仪, 由Analyst 1.6.2软件控制(美国AB SCIEX公司); 3-30K高速冷冻离心机(德国Sigma公司); 2510超声波清洗机(美国Branson公司); MS3旋涡混旋器(德国IKA-WERKE公司); 24孔N-EVAP氮吹仪(美国Organomation公司); Gradient A10 Milli-Q超纯水器(法国Millipore公司)。

甲醇和乙腈为液相色谱溶剂级(德国Merck公司), 甲酸为液相色谱溶剂级(美国Tedia公司)。

槟榔碱、吗啡、苦参碱、毛果芸香碱、氧化苦参碱、加兰他敏、麻黄碱、双氢可待因、可待因、甲基麻黄碱、消旋山莨菪碱、东莨菪碱、O-6-单乙酰吗啡、毒扁豆碱、苯甲酰爱康宁、阿托品、奎宁、蒂巴因、乙酰可待因、原阿片碱、罂粟碱、鬼臼毒素、那可丁、高乌甲素、新乌头碱、乌头碱和次乌头碱均为化学对照品(中国生物制品检定所); L-山梗菜碱(纯度为95%)、毒黄素(纯度≥98%)、4-羟基-N, N-二甲基色胺(100 mg/L)、N, N-二甲基色胺(1 000 mg/L)、黄夹苷A(对照品纯度未知)、藜芦定(纯度≥90%)、α-龙葵碱(纯度≥95%)和α-卡茄碱(纯度≥95%)(美国Sigma公司); 钩吻碱(纯度≥98%)、钩吻素子(纯度为98%)、钩吻素己(纯度为96%)、野靛碱(纯度为96%)、白屈菜红碱(纯度为97%)、雷公藤吉碱(纯度为95%)、雷公藤次碱(纯度为97%)、马兜铃酸I(纯度为98%)和马兜铃酸C(纯度为98%)(云南西力生物技术公司); 士的宁(纯度≥98%)和马钱子碱(纯度≥98%)(德国Merck公司); 苦杏仁苷(纯度＞97%)和相思豆毒素(对照品纯度未知)(东京化成工业株式会社); 夹竹桃甙(纯度≥95%)、蓖麻碱(对照品纯度未知)、吐根碱(纯度≥90%)、野黑樱苷(对照品纯度未知)和野百合碱(对照品纯度未知)(加拿大TRC公司); N-甲基野靛碱(纯度≥98%)、闹羊花毒素Ⅱ(纯度≥98%)、闹羊花毒素Ⅲ(纯度≥98%)、闹羊花毒素V(纯度≥98%)、介藜芦胺(纯度≥98%)、藜芦碱(纯度≥98%)、藜芦托素(纯度≥98%)、喜树碱(纯度≥98%)、常山碱(纯度≥98%)、异常山碱(纯度≥98%)、秋水仙碱(纯度≥98%)、商陆皂苷元(纯度≥98%)和商陆皂苷甲(纯度≥98%)(四川省维克奇生物科技有限公司); 石斛碱(纯度＞98%)、骆驼蓬碱(纯度＞98%)、石蒜碱(纯度＞98%)、文多灵(纯度＞98%)和苯甲酰乌头原碱(纯度＞98%)(大连美仑生物技术有限公司); 鱼藤酮(纯度≥99%)(德国Dr. Ehrenstorfer公司); 田麦角碱(100.2 mg/L)和麦角柯宁碱(100.3 mg/L)(美国Romer公司); 倒千里光碱、千里光碱和金雀花碱(对照品纯度未知, 美国ChromaDex公司); 毒芹碱(对照品纯度未知, 英国Fluorochem公司); 育亨宾(纯度为98%)(美国J&K Scientific公司)。茄啶由发芽马铃薯提取的总生物碱经2 mol/L HCl于100 ℃水解3 h后再纯化制得^[27]; 夹竹桃甙元由夹竹桃甙经0.05 mol/L HCl甲醇液温和酸水解后再纯化制得^[28]; 千里光碱-N-氧化物、野百合碱-N-氧化物和倒千里光碱-N-氧化物按文献方法^[29]由千里光碱、野百合碱和倒千里光碱经H₂O₂氧化制得, 再通过LC-MS/MS进行结构确认。

内标标准物质阿托品-d₅、秋水仙碱-d₆(对照品纯度未知, 加拿大TRC公司), 吗啡-d₃和可待因-d₃混合内标标准溶液(各20 mg/L, 美国o2si公司), 丁丙诺啡(对照品纯度未知, 中国生物制品检定所)。

健康人血浆购自温州市中心血站, 尿液由健康人提供。

1.2 仪器条件

1.2.1 色谱条件

分析柱为Acquity BEH C₁₈色谱柱(100 mm×2.1 mm, 1.7 μm), 保护柱为VanGuard BEH C₁₈保护柱(5 mm×2.1 mm, 1.7 μm)。流动相A:含0.1%(体积分数, 下同)甲酸和2 mmol/L甲酸铵的97%乙腈水溶液; 流动相B:含0.1%甲酸的2 mmol/L甲酸铵水溶液。梯度洗脱程序:0~1.00 min, 2%A; 1.00~3.00 min, 2%A~10%A; 3.00~6.00 min, 10%A~12%A; 6.00~9.50 min, 12%A~40%A; 9.50~13.00 min, 40%A~93%A; 13.00~13.10 min, 93%A~98%A; 13.10~15.00 min, 98%A; 15.00~15.10 min, 98%A~2%A; 15.10~17.00 min, 2%A; 流速:0.3 mL/min; 柱温:45 ℃; 进样体积:1 μL。

1.2.2 质谱条件

电喷雾离子源(ESI), 正离子扫描方式, 多离子监测-触发的增强子离子扫描(MRM-IDA-EPI)模式检测。离子化电压(IS): 5 500 V; 离子源温度(TEM): 300 ℃; 气帘气(CUR)压强:277 kPa(40 psi); 喷雾气(GS1)压强:483 kPa(70 psi); 辅助加热气压强(GS2): 483 kPa(70 psi); 碰撞器(CAD): High。优化后各待测物的母离子、子离子、去簇电压和碰撞能量的多反应监测(MRM)模式相关参数见表 1。增强子离子扫描的触发(IDA)参数:触发阈值为1 000 cps, 采用动态背景扣除模式; 增强子离子扫描(EPI)参数:扫描速度为20 000 Da/s, 扫描范围为m/z 50~900, 动态阱集时间不大于1 ms, EPI碰撞能量为50、90和130 eV。

表 1 (Table 1)

表 1 84种有毒植物成分和5种内标物的质谱参数 Table 1 MS parameters for the 84 toxic plant constituents and the five internal standards

表 1 84种有毒植物成分和5种内标物的质谱参数 Table 1 MS parameters for the 84 toxic plant constituents and the five internal standards

运行开始时, 色谱柱流出液经六通切换阀切换至废液, 1.30 min切换到离子源质谱进行测定采集数据, 直到12.7 min, 再将柱流出液切换至废液中。

1.3 混合标准物质的配制

分别将84种有毒植物成分的固体标准物质用适合的溶剂溶解, 用乙腈定容, 制成1.00 g/L的标准储备溶液, 然后混合, 配制成10 mg/L的混合标准溶液, 于-70 ℃保存。临用时再用40%甲醇水溶液稀释成1.0 mg/L的混合标准工作溶液。

阿托品-d₅、秋水仙碱-d₆和丁丙诺啡用甲醇溶解, 配制成100 mg/L的内标储备溶液, 然后用40%甲醇水溶液稀释5种内标储备溶液, 配制成混合内标标准工作溶液, 其中吗啡-d₃的质量浓度为0.10 mg/L, 可待因-d₃的质量浓度为0.10 mg/L, 阿托品-d₅的质量浓度为0.10 mg/L, 秋水仙碱-d₆的质量浓度为0.10 mg/L, 丁丙诺啡的质量浓度为1.0 mg/L。

1.4 样品前处理方法

吸取500 μL血浆于5 mL Eppendorf管中, 加入50 μL混合内标标准工作溶液, 混匀, 再加入2.0 mL乙腈, 旋涡30 s, 超声提取5 min, 以10 000 r/min的速度离心5 min, 上清液再通过除磷脂柱Prime HLB SPE柱(60 mg/3 mL), 重力自然流出, 流出液用氮气吹干后, 残渣溶于100 μL 40%甲醇水溶液中, 涡旋15 s, 转移至1 mL Eppendorf管中, 以15 000 r/min的速度离心5 min, 移取上清液至微量自动进样瓶中, 待测。

吸取1 000 μL尿液于2 mL Eppendorf管中, 加入50 μL混合内标标准工作溶液和700 μL甲醇, 混匀, 以15 000 r/min的速度离心5 min, 移取上清液至自动进样瓶中, 待测。

1.5 方法学验证

1.5.1 标准曲线的制作

分别在7份各500 μL空白血浆中加入适量混合标准溶液, 使各待测物质量浓度分别为0.03、0.3、1.0、5.0、10.0、20.0、100 μg/L。在7只2 mL Eppendorf管中加入小体积适量的混合标准溶液, 再加入空白尿液至1 000 μL, 使各待测物的质量浓度分别为0.30、1.0、5.0、20.0、40.0、80.0、200 μg/L。再分别按1.4节进行样品前处理后再测定, 采用MultiQuant定量软件进行数据处理, 以定量离子对与内标物的峰面积比值(y)对系列标准溶液质量浓度(x, μg/L)进行线性回归(权重取1/x)。

1.5.2 准确度和精密度

在血浆中加入适量混合标准工作溶液, 使各待测物质量浓度分别为0.30、1.0、5.0、20.0和80.0 μg/L, 在尿液中加入适量混合标准工作溶液, 使各待测物质量浓度分别为1.0、5.0、20.0和180 μg/L, 每个质量浓度水平平行试验6次, 一个工作日内进行测定, 计算日内准确度和精密度。在3个连续的工作日对上述加标浓度水平的样品进行测定, 计算日间准确度和精密度, 每个浓度水平平行试验6次。通过测量浓度与加标浓度的百分比来表示准确度, 通过测量浓度的相对标准差(RSD)来评估精密度。

1.5.3 基质效应和提取回收率

通过计算空白血浆或尿液经样品前处理后加入待测物的峰面积与含有相同浓度水平的溶剂标准物质的峰面积的比值进行基质效应的评估^[30]。血浆中84种有毒植物成分质量浓度水平分别为0.30、1.0、5.0、20.0和80.0 μg/L, 尿液中84种有毒植物成分质量浓度水平分别为1.0、5.0、20.0、80.0和180.0 μg/L, 平行试验5次。

通过计算加标样品中待测物的峰面积与空白血浆提取后加入相同浓度水平待测物的峰面积的比值来确定提取回收率。空白血浆加标水平分别为0.30、1.0、5.0、20.0和80.0 μg/L, 平行试验5次。尿液样品用甲醇稀释后直接进样测定。由于尿液中待测物的浓度比较低, 加入甲醇稀释有更好的溶解作用, 避免接触材料的吸附, 不会造成损失, 故不再评估其提取回收率。

在丁丙诺啡为50 μg/L、其他4种内标物为5.0 μg/L的水平下, 用相同的方法测定了血浆中内标物的提取回收率和基质效应。

1.5.4 稳定性试验

样品提取后在室温于自动进样器上放置72 h, 每隔24 h测定1次。

2 结果与讨论

2.1 质谱条件优化

将配制的质量浓度为1.0 mg/L的标准溶液分别通过注射泵注入质谱仪中, 进行参数优化。在电喷雾正离子电离模式下, 除苦杏仁苷、野黑樱苷、闹羊花毒素Ⅲ、黄夹苷A、马兜铃酸C、商陆皂苷甲、商陆皂苷元和马兜铃酸I在第1级四极杆全扫描时出现[M+NH₄]⁺峰、闹羊花毒素V出现[M-H₂O+H]⁺峰外, 其余化合物均出现[M+H]⁺峰。以这些加合物作为母离子进行碰撞解离, 通过子离子扫描得到目标化合物碎片离子信息, 然后再对去簇电压、碰撞能量等参数进行优化, 使分子离子对的信号达到最高。每种有毒植物成分选择响应最高的两对分子离子对, 以其中响应高的分子离子对作为定量离子对, 另一分子离子对作为定性离子对。设置MRM检测窗口为各待测物色谱峰的保留时间±30 s, 各目标物扫描时间(target scan time)为0.2 s, 由Analyst软件自动生成Scheduled MRM参数, 自动设定合适的峰驻留时间(dwell time), 使色谱峰的采样点数在12~20之间, 得到较好的定量重复性。然后对离子化电压、离子源温度、气帘气压强、喷雾气压强和辅助加热气压强等参数进行优化。试验发现, 较低的离子源温度有利于[M+NH₄]⁺加合物的生成, 使这些化合物的响应值较高, 故选择300 ℃的离子源温度进行后续试验。

考虑到某些中毒样品中有毒植物成分含量较低, 加上尿液和血浆中的基质成分非常复杂, 采用MRM法进行分析时, 如果质谱响应值比较低, 目标有毒植物成分容易受到基质成分的影响, 定性离子和定量离子丰度比值可能会超出容许范围, 会影响定性判定, 容易造成假阳性或假阴性的结果。采用多离子监测触发的增强子离子扫描(MRM-IDA-EPI)模式进行检测, 利用标准物质自建增强子离子扫描谱库, 检测时通过子离子谱库检索和匹配, 可提高定性能力, 更有利于复杂基质条件下的痕量有毒植物成分的准确定性。优化后的质谱条件见1.2.2节。

2.2 超高效液相色谱条件优化

考虑到方法的通用性, 试验选择了比较常用的Acquity BEH C₁₈色谱柱(100 mm×2.1 mm, 1.7 μm)作为分析柱进行后续优化。由于苦杏仁苷、野黑樱苷、闹羊花毒素Ⅲ、黄夹苷A、马兜铃酸C、商陆皂苷甲、商陆皂苷元、马兜铃酸I的质谱母离子为[M+NH₄]⁺, 因此流动相中应含有氨或铵盐。考虑到流动相对质谱响应值影响很大, 有文献^[31]报道碱性流动相可以改善阿片生物碱等碱性化合物的色谱行为, 色谱保留能力增强, 可在较高有机相比例下洗脱, 从而提高电喷雾离子化效率, 大部分待测物的响应值有数倍增加, 因此尝试采用碱性流动相(0.05%氨水乙腈溶液-0.05%氨水溶液), 并与中性流动相(乙腈-5 mmol/L甲酸铵的水溶液)和酸性流动相(含有0.1%甲酸和2 mmol/L甲酸铵的97%乙腈水溶液、含0.1%甲酸的2 mmol/L甲酸铵水溶液)进行比较。结果显示, 在碱性流动相下, 绝大多数待测物的响应值比中性和酸性流动相均有数倍乃至数十倍的提高, 但遗憾的是α-龙葵碱、α-卡茄碱和茄啶的响应值很低, 不能应用于血浆和尿液中低浓度的测定, 考虑到α-龙葵碱、α-卡茄碱和茄啶为发芽马铃薯引起中毒的标志物^[27], 非常重要, 故不采用碱性流动相。中性流动相与酸性流动相大部分待测物的响应值相当或互有高低, 但灵敏度不高的苦杏仁苷、马兜铃酸I、野靛碱、商陆皂苷元、闹羊花毒素Ⅲ等成分在酸性流动相条件下的响应值比中性流动相要高, 因此选择酸性流动相。

对酸性流动相中的甲酸、甲酸铵的浓度以及强洗脱成分(乙腈和甲醇)进行比较、优化, 最终选择含有0.1%甲酸和2 mmol/L甲酸铵的97%乙腈水溶液、含0.1%甲酸的2 mmol/L甲酸铵的水溶液作为色谱分离的流动相, 考虑到后续血浆样品采用的预处理方法, 尿液样品为稀释后直接进样分析, 样品进样液比较脏, 基质成分复杂, 因此采用比较平稳的梯度洗脱程序进行分离, 期望尽可能地将有毒植物成分与基质成分更好地分离。优化好的色谱分析条件见1.2.1节。分别取6份不同来源的空白血浆和尿液按本法进行测定, 样品中内源性基质成分不干扰84种待测物的测定。

由于本研究测定的化合物极性分布跨度大, 既有强极性成分, 又有弱极性成分, 而血浆和尿液样品进行前处理时使用的Eppendorf管、枪头等均为有机高分子材料, 会吸附弱极性化合物, 如雷公藤次碱、鱼藤酮、雷公藤吉碱和马兜铃酸I等, 经过试验发现, 当溶液中甲醇体积分数≥40%时, 弱极性待测物不会被吸附, 因此样品的进样溶剂选择40%甲醇水溶液。

对进样体积进行优化, 结果表明, 1 μL的进样体积不会引起明显的进样溶剂效应, 最终样品进样体积确定为1 μL。

2.3 样品前处理方法优化

本法测定的有毒植物成分种类较多, 化学性质各异, 有碱性、酸性、中性和酸碱两性, 极性分布范围广, 不能采用液液萃取法进行净化。考虑到中毒发生时, 毒物在血浆中浓度较低, 通常比尿液中的浓度要低数倍乃至数十倍, 而进样体积只有1 μL, 因此需要对血浆样品进行浓缩。血浆样品最常用的样品前处理方法有蛋白沉淀法和除磷脂法, 因此对二者进行比较。除磷脂法按1.4节进行处理, 同时在质谱方法中增加1个通道, 设置分子离子对为m/z 184.2＞m/z 184.2、去簇电压为250 V、碰撞能量为10 eV来监测磷脂出峰时间及强度, 得到的色谱图见图 1。蛋白沉淀法也按1.4节进行处理, 但省略除磷脂步骤, 质谱方法与除磷脂法一样, 进样分析获得色谱图(见图 2)。比较图 1和图 2可知, 通过除磷脂柱除去的磷脂主要集中于色谱强洗脱剂洗出的流分中(保留时间(t_R)＞12.7 min), 蛋白沉淀法处理的样品液中大量磷脂是在84种有毒植物成分中最后出峰的鱼藤酮之后才出峰, 虽然不影响测定, 但考虑到方法的稳健性和耐受性, 最终还是采用过Prime HLB SPE柱的除磷脂法, 这样有助于仪器保持较长时间的良好状态。同时通过切换阀将12.7 min之后流出的磷脂切换至废液中, 而不进入质谱污染系统。样品虽然经蛋白沉淀和除磷脂处理的最后样品液还有少量蛋白存在, 略显浑浊, 但此时不能过滤膜, 因为滤膜会吸附部分弱极性化合物, 可以以15 000 r/min的速度离心5 min去除蛋白, 取上清液进样分析。

图 1

Fig. 1

图 1 血浆加标样品乙腈沉淀去蛋白再过Prime HLB SPE柱的MRM总离子流色谱图 Fig. 1 Total ion chromatograms obtained for the analysis of spiked plasma treated by acetonitrile precipitation for protein removal followed by phospholipid removal on a Prime HLB SPE column a. total ion chromatogram of 84 analytes; b. total ion chromatogram of phospholipids.

图 2

Fig. 2

图 2 血浆加标样品乙腈沉淀去蛋白后的MRM总离子流色谱图 Fig. 2 Total ion chromatograms obtained for the analysis of spiked plasma treated by acetonitrile precipitation for protein removal a. total ion chromatogram of 84 analytes; b. total ion chromatogram of phospholipids.

尿液采用甲醇稀释后直接进样测定, 在1 000 μL尿液样品中加入700 μL甲醇使甲醇的体积分数＞40%, 不能用滤膜过滤, 可以以15 000 r/min的速度离心5 min去除沉淀, 取上清液进样分析。

再结合阀切换法将N-甲基野靛碱之前流出的色谱柱弱保留杂质和鱼藤酮之后出峰的强保留杂质切换至废液, 而不污染质谱系统。

2.4 内标物的选择

采用内标法定量可以校正待测物在样品前处理中的损失、质谱测定过程中的基质效应等, 从而得到更好的准确度和精密度。最理想的是采用稳定同位素稀释法进行定量检测, 由于本法测定化合物比较多, 经过试验最终选用吗啡-d₃、可待因-d₃、阿托品-d₅、秋水仙碱-d₆和丁丙诺啡作为内标物, 按色谱保留时间分区间进行校正, 具体见表 2。

表 2 (Table 2)

表 2 84种有毒植物成分的线性范围、回归方程、相关系数、检出限和定量限 Table 2 Linear ranges, regression equations, correlation coefficients(r), LODs, and LOQs of the 84 toxie plant constituents

表 2 84种有毒植物成分的线性范围、回归方程、相关系数、检出限和定量限 Table 2 Linear ranges, regression equations, correlation coefficients(r), LODs, and LOQs of the 84 toxie plant constituents

2.5 方法验证

2.5.1 方法的线性范围、检出限和定量限

84种有毒植物成分的线性范围、回归方程和相关系数见表 2, 相关系数均≥0.991 1, 线性关系良好。

在空白血浆和尿液样品中分别加入低浓度的有毒植物成分进行测定, 以分子离子对的信噪比≥3时的样品浓度作为检出限(LOD), 以信噪比≥10时的样品浓度作为定量限(LOQ), 试验测得血浆和尿液中84种有毒植物成分的检出限和定量限(见表 2)。血浆和尿液中84种有毒植物成分的检出限分别为0.01~1 μg/L和0.03~2 μg/L, 能够满足中毒检测的要求。

2.5.2 样品准确度和精密度

84种有毒植物成分的日内和日间准确度和精密度试验结果列于附表 1(详见http://www.chrom-China.com), 分析物的日内和日间精密度分别为0.7%~18.4%和1.1%~18.5%, 准确度为70.6%~124.5%, 结果符合中毒检测要求, 结果表明该方法对血浆和尿液中84种有毒植物成分的检测具有较高的准确度、精密度和重现性。

2.5.3 基质效应和提取回收率

基质效应和提取回收率见附表 1(详见http://www.chrom-China.com)。在4个质量浓度水平下, 84种有毒植物成分在血浆中基质效应为51.96%~127.39%, 回收率为43.86%~112.69%, 而尿液中基质效应为27.57%~136.80%。在5.0 μg/L水平下, 5种内标物的血浆和尿液的基质效应分别为75.60%~88.33%和60.76%~112.41%, 血浆的提取回收率为88.76%~105.05%。以上结果表明, 虽然样品中某些化合物的基质效应较明显(如尿液中氧化苦参碱和加兰他敏、血浆中槟榔碱和马兜铃酸C表现出一定的基质抑制效应; 尿液中商陆皂苷元、马兜铃酸I、喜树碱、闹羊花毒素Ⅱ、育亨宾、乙酰可待因、闹羊花毒素Ⅴ、吐根碱和苦杏仁苷等, 以及血浆中育亨宾均有一定的基质增强效应), 但对于多毒素同时测定的方法, 这些有毒植物成分的基质效应和提取回收率还是可以接受的, 通过基质加标内标法校正能够得到比较满意的结果, 符合中毒生物样品的快速检测的要求, 结果表明, 本方法仍不失为一种可行的检测方法。

2.5.4 稳定性试验

当提取的样品于室温保存, 72 h内84种有毒植物成分没有发生明显的降解。

2.6 实际样品的测定

对2012年7月2日温州市发生的一起误服掺有乌头类药酒的杨梅白酒中毒事件^{[32, 33]}的血浆和尿液留样样品进行重新检测。血浆样品和尿液样品中分别测得苯甲酰乌头原碱的质量浓度为0.47和26.4 μg/L(当时缺少该成分的标准物质, 没有测定此项目)。血浆样品中乌头碱、中乌头碱和次乌头碱均未检出; 尿液样品中乌头碱为12.7 μg/L, 中乌头碱和次乌头碱均未检出。检出阳性有毒植物成分的MRM色谱图和增强子离子扫描谱图见图 3。本次测得的浓度远低于原来的结果, 可能与样品经过长时间的冷藏保存后, 样品中含有的内源性酯类水解酶会分解乌头类生物碱的原因有关, 已有文献^{[34, 35]}报道, 乌头类生物碱在体内代谢迅速, 半衰期仅为2 min。

图 3

Fig. 3

图 3 血浆和尿液样品检出苯甲酰乌头原碱和乌头碱的MRM总离子流色谱图和增强子离子扫描谱图 Fig. 3 Total ion chromatograms and enhanced product ion scan spectra of benzoylaconine and aconitine in plasma and urine a. benzoylaconine in plasma; b. benzoylaconine in urine; c. aconitine in urine.

对2017年5月21日发生在沈阳市的某老农因食用发芽马铃薯发生中毒的血浆和尿液留样样品进行重新检测, 测得血浆中α-龙葵碱的质量浓度为1.11 μg/L, α-卡茄碱的质量浓度为3.32 μg/L, 茄啶未检出; 尿液样品中α-龙葵碱的质量浓度为0.62 μg/L, α-卡茄碱的质量浓度为0.75 μg/L, 茄啶未检出。检出阳性成分的MRM色谱图和增强子离子扫描谱图见图 4。血浆中原测定值α-龙葵碱的质量浓度为3.3 μg/L, α-卡茄碱的质量浓度为7.8 μg/L, 茄啶的质量浓度为3.1 μg/L(中毒4 h后采集的血清样品); 尿液样品中原测定值α-龙葵碱的质量浓度为0.70 μg/L, α-卡茄碱的质量浓度为1.5 μg/L, 茄啶的质量浓度为0.1 μg/L(中毒后第2天采集的尿液样品)。血浆中马铃薯生物碱的结果低于原来的结果, 可能与样品经过长时间的冷藏保存, 样品中待测物分解有关。

图 4

Fig. 4

图 4 血浆和尿液样品检出α-龙葵碱和α-卡茄碱的MRM总离子流色谱图和增强子离子扫描谱图 Fig. 4 Total ion chromatograms and enhanced product ion scan spectrum of α-solanine and α-chaconine in plasma and urine

3 小结

本文建立了测定血浆和尿液中84种有毒植物成分的超高液相色谱-三重四极杆/复合线性离子阱的质谱检测方法。通过对样品基质效应和提取回收率的评估, 验证了样品前处理方法的有效性, 通过对超高效液相色谱与质谱的检测条件的优化, 得到了较好的检测灵敏度, 自建84种有毒植物成分的增强子离子扫描谱库, 同时实现了MRM定量检测和增强子离子扫描谱库检索定性确证的双重功能, 进一步提高了复杂基质条件下低浓度待测物的定性能力。方法学考察表明, 该方法具有简便、快速、灵敏、准确等优点, 应用于实际样品的检测取得满意结果。本法适用于血浆和尿液中多种有毒植物成分的快速中毒检测和临床监测, 今后也可进一步拓展应用于植物和植物源保健食品中有毒成分的检测。

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