色谱  2019, Vol. 37 Issue (10): 1059-1063     DOI: 10.3724/SP.J.1123.2019.04050   PDF    
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魏敏芝
万建春
张富生
潘华
高效液相色谱-串联质谱法检测猪肉中3-甲基喹喔啉-2-羧酸残留
魏敏芝1, 万建春2, 张富生1, 潘华1     
1. 江西省农产品质量安全检测中心, 江西 南昌 330012;
2. 江西省食品检验检测研究院, 江西 南昌 330001
收稿日期：2019-04-30
基金项目：江西省重点研发计划项目（20181BBF60027）
通讯联系人：潘华, Tel:(0791)88509111, E-mail:18449807@qq.com
摘要：建立了高效液相色谱-串联质谱同时定量和确证猪肉中3-甲基喹喔啉-2-羧酸（MQCA）残留量的检测方法。试样用0.3 mol/L盐酸溶液水解提取，加入乙腈和乙酸乙酯萃取，再用0.1 mol/L氢氧化钠溶液反萃取，阴离子交换固相萃取柱净化，经Agilent Eclipse Plus C18柱（50 mm×3.0 mm，1.8 μm）分离，采用液相色谱-串联质谱仪检测，基质匹配添加标准曲线定量。MQCA在1.0~50 μg/L范围内线性相关系数大于0.99，在0.5、1.0、5.0 μg/kg加标水平下其回收率为90.5%~119.6%，相对标准偏差为3.14%~4.22%。方法可用于猪肉中MQCA残留量的快速定量和确证检测。
关键词：液相色谱-串联质谱    触发式多反应监测    确证    3-甲基喹喔啉-2-羧酸    猪肉    
Determination of 3-methyl-quinoxaline-2-carboxylic acid residue in pork by high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry
WEI Minzhi1, WAN Jianchun2, ZHANG Fusheng1, PAN Hua1     
1. Test Center for Agriculture Product Quality and Safety of Jiangxi Province, Nanchang 330012, China;
2. Jiangxi Food Inspection and Testing Research Institute, Nanchang 330001, China
Foundation item: Key Science and Technology Program Project of Jiangxi Province (No. 20181BBF60027)
Abstract: A method was developed for the simultaneous quantitative and confirmatory determination of 3-methylquinoxaline-2-carboxylic acid (MQCA) residues in pork by high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (HPLC-MS/MS). The sample was hydrolyzed with 0.3 mol/L hydrochloric acid solution, and MQCA was extracted by water bath oscillation. MQCA was first extracted with acetonitrile and ethyl acetate and then re-extracted from the extraction solution with 0.1 mol/L sodium hydroxide solution. Then MQCA was purified by an anion exchange solid phase extraction column. The chromatographic separation was performed using an Agilent Eclipse Plus C18 column (50 mm×3.0 mm, 1.8 μm). The quantitative analysis was performed by the matrix matching addition method. The correlation coefficient of MQCA in the range of 1.0-50 μg/L was greater than 0.99. The recovery was 90.5%-119.6% at the spiked levels of 0.5, 1.0 and 5.0 μg/kg, and the relative standard deviation was 3.14%-4.22%. The method can be used for the rapid quantitative determination of 3-methylquinoxaline-2-carboxylic acid residues in pork.
Key words: high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (HPLC-MS/MS)     triggered multi-reaction monitoring     confirmation     3-methyl-quinoxaline-2-carboxylic acid     pork    

喹乙醇是广谱抗菌药物, 对革兰氏阳性和阴性菌都有抑制作用, 尤其对猪痢疾疗效显著。我国农业部168号公告规定, 不超过35 kg仔猪可以使用喹乙醇药物, 用于促进其生长。动物喂食给药的喹乙醇大部分以原形药经尿液排泄到体外, 此外其代谢产物还包括1-或4-单氮氧化物和3-甲基喹喔啉-2-羧酸(MQCA), 其中MQCA被国际食品法典委员会认定为喹乙醇残留标志物。我国农业部公告235号规定猪肉中MQCA的限量值为4 μg/kg, 欧盟和美国则禁止在动物养殖中使用喹乙醇。2018年我国农业部发布2638号公告, 要求停止生产喹乙醇原料药及各种制剂; 2019年5月1日起, 喹乙醇被纳入动物养殖禁止使用的药物范围。

目前, 动物源食品中MQCA残留量的前处理方式有酸解[1, 2]和蛋白酶水解[3], 其中酶解操作步骤繁琐, 检测用时较长, 而酸解处理的方式也更为便捷, 且有文献报道[1, 4]可以通过提高酸解温度缩短水解时间。动物源食品中MQCA残留量的检测方法主要有酶联免疫吸附法[5, 6]、气相色谱-质谱法[7]、高效液相色谱法[1, 8]和液相色谱-串联质谱法[9-14]。液相色谱-串联质谱法具有高选择性和高灵敏度的特点, 适合食品中禁用药物残留量的测定。MQCA的相对分子质量较小, 质谱检测易受干扰而影响定性判断, 而通过更多的特征碎片离子信息匹配度的比较, 可以提高方法的抗干扰能力。本文建立了液相色谱-串联质谱检测猪肉中MQCA残留量的方法, 采用触发式多反应监测模式实现同时定量和确证, 可为准确监控猪肉中MQCA的残留状况提供更可靠的检测技术。

1 实验部分
1.1 仪器、试剂与材料

1260-6470型液相色谱-串联质谱仪(配ESI源)、VAC ELUT-20固相萃取装置(美国Agilent公司); Vortex-Genie2涡旋混匀器(美国Scientific Industries公司); SHA-B恒温水浴振荡器(常州智博瑞仪器制造有限公司)。

MQCA(纯度99.0%, 德国Dr. Ehrenstorfer公司); 盐酸、氯化钠(上海国药集团); 氢氧化钠(分析纯, 天津市大茂化学试剂厂); 氨水(质谱纯, 上海安谱公司); 乙酸乙酯、甲醇、乙腈(色谱纯, 美国Honeywell公司); 甲酸(色谱纯, 美国Sigma公司)。强阴离子固相萃取小柱(MAX, 150 mg/6 mL, 美国Waters公司); 水为Milli-Q超纯水。

确证测试样品:猪肉样品由中国检验检疫科学研究院提供(编号17-D707), MQCA残留量为3.52 μg/kg。

1.2 样品前处理

称取匀浆后的猪肉试样2.0 g, 置于50 mL聚丙烯离心管中, 加入10 mL 0.3 mol/L盐酸溶液, 于50 ℃水浴振荡提取30 min, 依次加入5 mL乙腈、15 mL乙酸乙酯、2.5 g氯化钠, 涡旋混合1 min, 以8000 r/min离心5 min, 上层有机相全部转移至另一50 mL聚丙烯离心管中; 加入5 mL 0.1 mol/L氢氧化钠溶液, 涡旋混合30 s, 以8000 r/min离心5 min。吸取下层全部水相层转入经5 mL甲醇、5 mL水活化的MAX小柱内, 再分别用5 mL水、5 mL甲醇、5 mL乙酸乙酯淋洗, 用空气吹干小柱内液体。用8 mL甲酸-乙酸乙酯(2:98, v/v)溶液洗脱, 收集全部洗脱液, 于45 ℃下氮气吹干, 用1 mL 0.1%(v/v)甲酸水溶液-乙腈(5:95, v/v)溶液溶解残渣, 过0.22 μm尼龙滤膜, 供LC-MS/MS测定。

1.3 标准溶液的配制

准确称取10 mg MQCA标准品, 置于10 mL容量瓶中, 用甲醇溶解定容, 配制1.0 g/L标准储备液, 于-18 ℃下保存; 用甲醇稀释标准储备液, 制得MQCA标准中间液, 临用现配。

基质匹配添加标准工作溶液:称取6份阴性猪肉试样, 分别加入MQCA标准中间液, 按1.2节处理, 获得质量浓度为1、2、5、10、20、50 μg/L系列标准工作溶液。

1.4 分析条件

色谱柱:Agilent Eclipse Plus C18柱(50 mm×3.0 mm, 1.8 μm); 柱温:35 ℃; 流动相A：乙腈；流动相B：0.1%(v/v)甲酸水溶液; 流速:0.3 mL/min。梯度洗脱条件:0~1.00 min, 5%A; 1.00~2.00 min, 5%A~40%A; 2.00~3.00 min, 40%A~90%A; 3.00~4.00 min, 90%A; 4.00~4.01 min, 90%A~5%A; 4.01~7.00 min, 5%A。进样体积:5 μL。

离子源:ESI源, 正离子模式; 扫描模式:动态多反应监测(dynamic MRM); 毛细管电压:3500 V; 雾化气压力:310.2 kPa; 鞘气温度:325 ℃; 鞘气流量:12 mL/min; 喷嘴电压:500 V; 干燥气温度:200 ℃; 干燥气流量:11 mL/min; 碎裂电压:135 V。触发扫描阈值:100 cps; 触发进入时间:2 ms; 触发延迟时间:2 ms。MQCA的特征离子对和碰撞能量见表 1。

表 1 MQCA的质谱参数 Table 1 MS parameters of 3-methylquinoxaline- 2-carboxylic acid (MQCA)
2 结果与讨论
2.1 质谱条件的优化

MQCA结构中有喹啉杂环, 离子化时得到质子, 形成[M+H]+母离子。在15、20和25 eV碰撞能量下分别碎裂母离子, 获得不同碰撞能量下的二级子离子全扫描质谱图(见图 1)。碰撞能量为15 eV时, 得到m/z为145.1、143.2、117.8、91.9、76.9的碎片离子, 此碰撞能量下仍可见m/z为189.0的母离子, 但相对丰度很低。碰撞能量提高至20 eV时, m/z为145.1和143.2的碎片离子强度有所下降, 子离子全扫质谱图中增加了m/z为127.9、102.1、65.0的特征峰, 母离子的响应强度则与背景噪音水平相当。碰撞能量提高至25 eV时, 没有新碎片离子增加, 所有碎片离子的响应强度基本和碰撞能量20 eV下相当, 由此确定MQCA的二级碎片离子的m/z为145.0、143.0、128.1、117.9、102.3、91.8、77.0和65.2。进一步优化各碎片离子的最佳碰撞能量, m/z为145.0和143.0两个特征离子的响应丰度最高, 可作为多反应监测扫描离子, 其中m/z为145.0的特征离子作为触发扫描离子。

图 1 不同碰撞能量下MQCA的二级质谱图 Fig. 1 MS/MS spectra of MQCA under different CEs
2.2 色谱条件的优化

MQCA具有酸碱两性的特点, 其在酸性环境条件下, 表现出疏水性, 反相色谱柱适合其分离。Agilent Eclipse Plus C18色谱柱(50 mm×3.0 mm, 1.8 μm)的固定相粒径小, 具有良好的保留性能, 同时能缩短分析时间, 适合酸性、碱性和中性化合物的分离。本文通过优化梯度洗脱条件, 获得了MQCA尖锐、对称的色谱峰形和良好的色谱保留(见图 2)。本文用获得的阴性猪肉基质提取测试液, 配制基质标准溶液, 对比了定容液配制的试剂标准溶液的分离效果(见图 3)。结果表明, MQCA能够与基质背景中的大部分极性和弱极性干扰物分离, 可以降低干扰物共流出对MQCA电离的影响。

图 2 MQCA标准溶液(5 μg/L)触发式多反应监测色谱图 Fig. 2 Trigger MRM chromatograms of MQCA standard solution (5 μg/L)

图 3 阴性猪肉样品、基质标准溶液和试剂标准溶液(5 μg/L)的总离子流色谱图 Fig. 3 TIC chromatograms of blank pork sample, matrix standard solution and reagent standard solution (5 μg/L)
2.3 样品前处理条件的优化

动物组织样品中MQCA残留量的检测多采用酶解[3, 4]或酸水解[1, 15]的前处理方式。酶解成本高, 用时长, 操作也繁杂; 采用酸水解的方式, 可以通过提高水解的温度, 进而缩短水解时间。本文比较了2.0 mol/L和0.3 mol/L盐酸的水解效果, 实验发现, 采用0.3 mol/L盐酸水解提取后, 提取液仍是酸性环境, 这适合有机溶剂直接萃取目标物, 而且提取效果也与采用2.0 mol/L盐酸时一致, 因此确定水解提取的盐酸浓度为0.3 mol/L。

实验比较了不同萃取试剂的萃取效果, 分别采用正己烷、乙酸乙酯、乙腈-乙酸乙酯(1:3, v/v)3种溶剂。采用正己烷萃取, 萃取效率最低, 且样液乳化严重, 高速离心后仍有一定乳化现象; 采用乙酸乙酯萃取, 乳化情况稍好; 采用乙腈和乙酸乙酯混合体系萃取时, 萃取效率最高, 且试样液中加入乙腈, 可以沉淀试样液中的蛋白质, 再加入乙酸萃取, 能明显改善样液的乳化现象。

MQCA在碱性条件可用阴离子交换固相萃取柱净化[16]。萃取液中加入氢氧化钠溶液, MQCA呈阴离子态, 可被MAX小柱吸附。实验依次用水、甲醇、乙酸乙酯淋洗小柱, 以除去极性和非极性杂质, 最后用酸化乙酸乙酯洗脱目标物。本文对洗脱溶液体积进行了优化, 将含5.0、10.0和50.0 μg/kg 3个水平的上样液分别加入小柱, 经淋洗后, 用酸化乙酯乙酯分多次洗脱小柱, 每次用2 mL洗脱液, 分别测试每次洗脱液中MQCA的含量, 发现第4次洗脱小柱后, 只有50.0 μg/kg水平试验的洗脱液中有少量目标物检出。当洗脱液增加到10 mL时, 3个水平下的收集液中均未检出目标物。因此最终本文确定洗脱体积为8 mL。

2.4 定量测定

用阴性猪肉样品进行加标实验, 以目标物信噪比(S/N)的3倍和10倍水平分别确定检出限和定量限, 分别为0.15 μg/kg和0.5 μg/kg。

用阴性猪肉样品按前述方法制备获得的空白基质溶液, 对比相同浓度的基质标准溶液与试剂标准溶液的响应值, 发现样品净化后有基质增强效应, 因此本文确定用基质匹配添加标准曲线定量。在1.0~50 μg/L范围内, MQCA呈线性相关, 相关系数(R2)为0.9997。在0.5、1.0、5.0 μg/kg3个水平下进行加标回收试验, MQCA的回收率为90.5%~119.6%, 相对标准偏差为3.14%~4.22%(见表 2)。

表 2 猪肉中MQCA的加标回收率(n=6) Table 2 Recoveries of MQCA spiked in pork (n=6)
2.5 确证实验

定性离子丰度比或特征离子匹配度是质谱确证的主要方式, 多反应监测的选择性很高, 但仍存在基质干扰导致假阳性的风险, 尤其是小分子化合物的检测。为提高确证结果的可靠性, 选择数量更多特征碎片离子的定性判断会更可靠, 但若连续监测全部离子对, 会降低质谱循环扫描时间, 影响定量结果数据点的获取。触发式多反应监测不仅能满足定量分析的要求, 而且可以通过触发的二次扫描, 获得化合物确证的质谱谱库[17], 通过比对样品谱图与标准品谱图, 实现确证样品中的待测物。实验采用中国检验检疫科学研究院提供的猪肉样品进行确证实验, 测得样品中MQCA含量为3.46 μg/kg, 同时也获得触发式MRM的质谱图。将该图与标准品谱图比对(见图 4), 表明测试样品所获特征离子与标准谱图全部匹配。通过阳性样品的验证测试, 表明本方法可实现准确定量和确证。

图 4 MQCA确证测试样品质谱图与参考标准品质谱图对比 Fig. 4 Comparison of mass spectra of the MQCA confirmed test sample with reference standard sample
3 结论

本文建立了液相色谱-串联质谱法测定猪肉中MQCA残留量的方法, 方法采用触发式多反应监测模式, 准确定量的同时也能获取更多的质谱信息, 对于基体复杂的样品能实现可靠的定性确证。方法采用基质匹配添加标准曲线定量, 方法回收率高, 检出限低, 适合猪肉中MQCA残留量的快速测定和确证。

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