色谱  2019, Vol. 37 Issue (11): 1179-1184     DOI: 10.3724/SP.J.1123.2019.05011   PDF    
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何书海
曹小聪
吴海军
李腾崖
张鸣珊
梁焱
陈表娟
直接进样超高效液相色谱-三重四极杆质谱法快速测定环境水样中草甘膦、氨甲基膦酸、草铵膦及乙烯利残留
何书海1,2, 曹小聪1,2, 吴海军3, 李腾崖1,2, 张鸣珊1,2, 梁焱1,2, 陈表娟1,2     
1. 海南省环境科学研究院, 海南 海口 571126;
2. 海南省环境监测中心站, 海南 海口 571126;
3. SCIEX公司, 广东 广州 510000
收稿日期：2019-05-09
通讯联系人：何书海.Tel:(0898)66711210, E-mail:heshuhai1981@163.com
摘要：建立了一种简便、直接进样的超高效液相色谱-三重四极杆质谱法（UPLC-MS/MS）快速测定环境水样中草甘膦、氨甲基膦酸、草铵膦及乙烯利的残留。环境水样经0.22 μm滤膜过滤或冷冻离心去除杂质后，滤液无需衍生化直接进行定量分析。4种农药通过Metrosep A Supp 5柱（150 mm×4.0 mm，5 μm）分离，以碳酸氢铵-氨水溶液为流动相进行梯度洗脱，在负离子模式下以MRM方式进行检测。结果表明，4种农药在0.50~50.0 μg/L范围内相关系数（r）均大于0.999，线性关系良好，方法检出限为0.05~0.09 μg/L。实际水样在低、中、高3种加标浓度水平下，回收率分别为76.3%~108%、83.0%~107%和87.0%~105%，相对标准偏差分别为2.0%~12.3%、2.4%~5.6%和2.7%~6.8%。使用该方法对海南省34个水样进行测定，其中30个饮用水源地水样中均未检出4种农药，槟榔园附近3个水样均检出草甘膦和氨甲基膦酸，香蕉园附近的1个水样检出草铵膦和氨甲基膦酸。与传统的衍生化方法比较，该方法操作简便，重现性好，准确性高，不受基体干扰，适用于环境水样中草甘膦、氨甲基膦酸、草铵膦及乙烯利的残留检测。
关键词：超高效液相色谱-三重四极杆质谱    直接进样    草甘膦    氨甲基膦酸    草铵膦    乙烯利    环境水样    
Rapid determination of glyphosate, aminomethyl phosphonic acid, glufosinate, and ethephon residues in environmental water by direct injection-ultra performance liquid chromatography-triple quadrupole mass spectrometry
HE Shuhai1,2, CAO Xiaocong1,2, WU Haijun3, LI Tengya1,2, ZHANG Mingshan1,2, LIANG Yan1,2, CHEN Biaojuan1,2     
1. Hainan Province Research Academy of Environmental Sciences, Haikou 571126, China;
2. Hainan Province Environmental Monitoring Centre, Haikou 571126, China;
3. SCIEX Analytical Instrument Trading Co., Guangzhou 510000, China
Abstract: A simple method based on direct injection-ultra performance liquid chromatography-triple quadrupole tandem mass spectrometry (UPLC-MS/MS) was established for the rapid determination of glyphosate, aminomethyl phosphonic acid, glufosinate, and ethephon residues in environmental water. The water samples were filtered through a 0.22-μm filter membrane or frozen and centrifuged to remove impurities, and then, the filtrate was directly subjected to quantitative analysis without derivatization. The analytes were separated on a Metrosep A Supp 5 column (150 mm×4.0 mm, 5 μm), and gradient elution was carried out using an ammonium bicarbonate-ammonia solution as the mobile phase. The data were collected by positive electrospray ionization in the multiple reaction monitoring (MRM) mode. The results showed that the correlation coefficients (r) of the linear calibration curves were greater than 0.999 in the corresponding linear ranges (0.50-50.0 μg/L). The detection limits of the analytes were 0.05-0.09 μg/L. The recoveries of glyphosate, aminomethyl phosphonic acid, glufosinate, and ethephon were in the ranges 76.3%-108%, 83.0%-107%, and 87.0%-105% at low, medium, and high spiked levels, respectively. The corresponding relative standard deviations were in the ranges 2.0%-12.3%, 2.4%-5.6%, and 2.7%-6.8%. Using this method, 34 water samples collected from Hainan Province were analyzed, among which 30 drinking water sources were found to be free from the four pesticides. Glyphosate and aminomethyl phosphonic acid were detected in three water samples near a betel nut orchard, while glufosinate and aminomethyl phosphonic acid were detected in a water sample near a banana orchard. This method is advantageous over the traditional derivatization method because of its simple operation, good reproducibility, and high accuracy; furthermore, the matrix interference effect is absent. Thus, this method is suitable for analyzing glyphosate, aminomethyl phosphonic acid, glufosinate, and ethephon residues in environmental water samples.
Key words: ultra performance liquid chromatography-triple quadrupole mass spectrometry (UPLC-MS/MS)     direct injection     glyphosate     aminomethyl phosphonic acid     glufosinate     ethephon     environmental water    

草甘膦(glyphosate)是目前世界上使用量最大的除草剂, 广泛应用于农业和非农业领域[1]; 草铵膦(glufosinate)是触杀型灭生性除草剂, 可防治大部分抗草甘膦药性杂草, 近年来被广泛使用[2, 3]。草甘膦和草铵膦经常在植物、土壤、水、甚至食物和人体尿液中检出[4], 因此备受社会关注。国际癌症研究机构(IARC)研究报告显示草甘膦除草剂可能对人类致癌[5]。欧洲化学品管理局(ECHA)研究报告显示草甘膦会对眼睛造成严重损害, 对水生生物产生毒性, 影响持久[6], 但ECHA的研究报告没有考虑草甘膦主要代谢物氨甲基膦酸(aminomethyl phosphonic acid, AMPA)的潜在风险, 因此需对其潜在危害加以重视[7]。乙烯利(ethephon)是植物生长调节剂, 具有促进果实成熟、调节性别转化等效应, 在果蔬催熟领域中广泛使用, 研究表明乙烯利具有神经毒性, 长期使用会对动物免疫和生殖系统造成一定损害[8]。

由于草甘膦、氨甲基膦酸、草铵膦和乙烯利均属于强极性化合物, 易溶于水, 且草甘膦和草铵膦缺少发色和荧光基团[2, 9-11], 其分析检测难度较大。目前有关4种农药的分析方法很多, 有分光光度法[12]、高效液相色谱法[13-15]、气相色谱法[16, 17]、离子色谱法[7, 18-20]、气相色谱-质谱法[21-23]、高效液相色谱-串联质谱法[2, 3, 24-27]和电感耦合等离子体质谱法[1, 28]等, 大多数分析方法均需进行柱前或柱后衍生。衍生化虽能提供较好的灵敏度, 但操作过程繁琐, 重现性差, 且仅限于一种或两种分析物。基于现有方法存在的问题, 需建立一种快速、高效、便捷、灵敏的检测方法。本研究利用离子交换色谱柱在常规液相色谱上与串联质谱连接, 快速测定环境水样中草甘膦、氨甲基膦酸、草铵膦及乙烯利。

1 实验部分
1.1 仪器与试剂

LC-30AD超高效液相色谱(日本岛津公司), Triple Quad 6500+三重四极杆质谱联用仪(美国AB Sciex公司), 配IonDriveTM Turbo V离子源; Milli-Q超纯水仪(美国Millipore公司); 高速冷冻离心机(美国ThermoFisher Scientific公司)。氨水为分析纯(广州化学试剂厂), 碳酸氢氨为优级纯(阿拉丁公司); 尼龙(Nylon)、聚四氟乙烯(PTFE)、醋酸纤维(CA)、聚醚砜(PES)、聚偏氟乙烯(PVDF)滤膜均为针式过滤头(孔径0.22 μm, 直径13 mm)。

草甘膦(纯度99%)、氨甲基膦酸(纯度99%)、草铵膦(纯度97.5%)及乙烯利(纯度96%)购于美国AccuStandard公司。

1.2 标准溶液

准确称取一定量的草甘膦、氨甲基膦酸、草铵膦和乙烯利于10 mL棕色容量瓶中, 用纯水定容至刻度线, 得到1 000 mg/L的标准贮备液。标准贮备液用纯水稀释成质量浓度为100 μg/L的中间使用液。标准曲线浓度临用现配。

1.3 采样点位

2019年4月分别采集海南省18个市县30个点位饮用水源地水样、槟榔园附近3个水样及香蕉园附近1个水样, 其位置分布见图 1。水样严格按照HJ 91-2002技术规定要求进行采集。采集水样装入棕色磨口玻璃瓶中, 于4 ℃下冷冻箱中保存。

图 1 采样点位分布示意图 Fig. 1 Map illustrating sampling locations
1.4 样品预处理

环境水样过0.22 μm滤膜后, 待超高效液相色谱-三重四极杆质谱仪测定; 若样品含有杂质较多或样品较为浑浊, 需对样品进行离心, 于4 ℃以12 000 r/min离心5 min后测定。

1.5 超高效液相色谱分析条件

离子交换柱为Metrosep A Supp 5 (150 mm×4.0 mm, 5 μm); 流动相为碳酸氢铵-氨水溶液(B)和纯水(A), 采用梯度洗脱程序, 5%B(0~0.5 min), 5%B升至80%B(0.5~2.0 min), 80%B(2.0~6.5 min), 80%B降至5%B(6.5~6.51 min), 5%B(6.51~10.0 min); 柱箱温度为40 ℃; 柱流速为0.4 mL/min; 进样体积为20.0 μL。

1.6 串联质谱分析条件

电喷雾负离子模式(ESI-); 喷雾电压(IS)-4 500 V; 离子源温度(TEM)600 ℃; 气帘气(CUR)压力207 kPa(30 psi); 喷雾气(GS1)压力379 kPa(55 psi); 辅助加热气(GS2)压力379 kPa(55 psi); 驻留时间(dwell time)50 ms。4种农药的质谱参数见表 1。

表 1 4种农药检测的质谱条件 Table 1 MS/MS conditions for the detection of the four pesticides
2 结果与讨论
2.1 色谱柱条件的优化

由于草甘膦类农药均为极性物质, 在常规C18色谱柱上保留较差, 并且存在严重的基质干扰, 通常需要使用芴甲氧羰酰氯(Fmoc-Cl)试剂衍生化才能保留; 在亲水性HILIC色谱柱上, 该类化合物可很好地保留, 但是峰形拖尾严重, 影响定量。本文对比了欧盟EURL-SRM推荐的色谱柱Hypercarb (50 mm×2.1 mm, 5 μm)、美国FDA推荐的色谱柱Acclaim Trinity Q1 (100 mm×3.0 mm, 5 μm)以及离子交换柱Metrosep A Supp 5(50 mm×2.1 mm, 5 μm)在各自的优化条件下, 利用常规的液相色谱-串联质谱对这几种目标物的分离效果。结果表明:Hypercarb色谱柱上草甘膦拖尾严重, 其他几种物质峰形较宽; 在Acclaim Trinity Q1色谱柱上所有目标物的峰形较好, 但是与离子交换柱Metrosep A Supp 5相比, 具有重复性差、灵敏度低等缺点。因此, 本实验最终选择Metrosep A Supp 5作为分析色谱柱, 在该色谱柱上的典型色谱图见图 2。

图 2 4种农药(50.0 μg/L)在MRM模式下的提取离子色谱图 Fig. 2 Extracted ion chromatogram of the four pesticides (50.0 μg/L) separated on Metrosep A Supp 5 column Peaks: 1. AMPA; 2. glufosinate; 3. glyphosate; 4. ethephon.
2.2 串联质谱条件的优化

实验首先采用负离子全扫描模式扫描4种化合物, 分别确定其母离子, 并对其已确认的母离子进行二级质谱Product Ion扫描, 得到子离子。根据响应强度高、基线噪声低、抗干扰能力强的原则, 最终选择一个母子和两个子离子。并在MRM模式下对每种目标化合物离子对的碰撞能量、去簇电压等质谱参数进行了优化, 见表 1。

2.3 样品前处理条件的优化

样品中的细微杂质等易造成超高效液相色谱系统堵塞, 因此在上机分析前需对样品进行前处理。本研究比较了不同材质的0.22 μm滤膜对4种农药回收率的影响, 分别选择Nylon、PES、PVDF、PTFE、CA等5种针式过滤膜对4种农药含量均为5.00 μg/L的水样进行过滤。实验结果见图 3, Nylon对草甘膦和乙烯利均有一定的吸附, 草甘膦和乙烯利损失率分别为19%和16%; PES对草甘膦也有一定的吸附, 损失率为12%;乙烯利经过PTFE过滤处理后回收率达到117%, 表明过膜后乙烯利有明显的增值效应。水样经过PVDF和CA过滤后, 4种农药均获得较好的回收效果, 满足分析要求, 考虑价格因素, 最终选择CA过滤处理样品。

图 3 不同滤膜处理水样对4种农药回收率的影响 Fig. 3 Effect of different filter membranes on the recovery of the four pesticides in environmental water samples Nylon: polyamide; PES: polyethersulfone; PVDF: polyvinylidene fluoride; CA: cellulose acetate; PTFE: polytetrafluoroethylene.

对于浑浊的废水样品可通过离心方式去除颗粒物。在基体复杂的废水中加入4种农药, 于4 ℃以12 000 r/min离心5 min后进行测定。结果显示, 4种农药的回收率均可达到91%以上, 达到分析要求。

2.4 线性范围及检出限

分别配制0.50、1.00、5.00、10.0、20.0和50.0 μg/L的4种农药混合标准溶液。按照最终优化后的仪器条件, 从低浓度到高浓度依次进样分析, 得到不同浓度目标物的质谱图, 在0.50~50.0 μg/L范围内4种农药的相关系数(r)均大于0.999, 线性关系良好。

按照HJ 168-2010要求, 并考虑仪器灵敏度, 本实验配制4种农药含量均为0.50 μg/L的7份纯水样进行检出限试验, 结果见表 2。当进样体积为20.0 μL时, 4种农药的方法检出限为0.05~0.09 μg/L, 方法定量限分别为0.20~0.36 μg/L。与Lajin等[1]、Hao等[29]和Demonte等[30]报道的方法相比较, 本研究的检出限远低于其报道结果。

表 2 4种农药的回归方程、相关系数、检出限和定量限 Table 2 Linear regression equations, correlation coefficients (r), LODs, and LOQs of the four pesticides
2.5 实际样品测定、方法准确度和精密度

采用优化后的实验条件对海南省18个市县30个点位饮用水源地水样、槟榔园附近3个水样及香蕉园附近1个水样及部分加标样品进行分析。结果显示海南省18个市县30个(1#~30#)饮用水源地水样中均未检出草甘膦、氨甲基膦酸、草铵膦及乙烯利, 槟榔园附近3个(31#~33#)水样中均检出草甘膦和氨甲基膦酸, 其水样中草甘膦的质量浓度为0.67~0.91 μg/L, 氨甲基膦酸的质量浓度为1.43~1.67 μg/L; 香蕉园附近水样中检出草铵膦和氨甲基膦酸, 草铵膦的质量浓度为0.63 μg/L, 氨甲基膦酸的质量浓度为0.21 μg/L。

同时对31#和34#样品进行3个不同浓度水平的加标试验, 结果见表 3, 相关谱图见图 4。结果表明, 回收率分别为76.3%~108%、83.0%~107%和87.0%~105%, 相对标准偏差(RSD)分别为2.0%~12.3%、2.4%~5.6%和2.7%~6.8%, 说明该法准确度高, 重现性好, 对不同水质样品适用性均良好。

表 3 4种农药在两个环境水样中的加标回收率及RSD(n=6) Table 3 Recoveries and RSDs of the four pesticides spiked in two environmental water samples (n=6)

图 4 MRM模式下两个样品及其加标样品的色谱图 Fig. 4 Extracted ion chromatograms of two samples and their spiked samples in MRM mode Spiked level: 10.0 μg/L. Peak Nos. are the same as in Fig. 2.
3 结论

本研究建立了一种无需衍生化直接快速检测环境水样中草甘膦、氨甲基膦酸、草铵膦及乙烯利的分析方法, 方法将离子交换色谱柱用于常规液相色谱分离, 具有良好的稳定性。与传统的衍生化方法比较, 具有操作简便、节省时间、灵敏度高、准确性好、重现性好等优点, 可在10 min内完成环境水样中草甘膦、氨甲基膦酸、草铵膦及乙烯利的检测。

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