色谱  2019, Vol. 37 Issue (11): 1173-1178     DOI: 10.3724/SP.J.1123.2019.05017   PDF    
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洪灯
谢文
侯建波
胡晓莉
史颖珠
李杰
高效液相色谱-四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱法快速筛查保健食品中的西布曲明及其5种衍生物
洪灯, 谢文, 侯建波, 胡晓莉, 史颖珠, 李杰     
浙江省检验检疫科学技术研究院, 浙江 杭州 311215
收稿日期：2019-05-17
基金项目：浙江出入境检验检疫局项目（ZK201709）
通讯联系人：洪灯.Tel:(0571)83527226, E-mail:denghong_chem@126.com
摘要：建立了高效液相色谱-四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱（HPLC-Q/Orbitrap HRMS）快速筛查保健食品中的西布曲明及其5种衍生物的方法。样品经甲醇超声提取，高速离心，Hypersil Gold色谱柱（100 mm×2.1 mm，3 μm）分离，以甲醇与0.15%（v/v）甲酸水溶液为流动相进行梯度洗脱，正离子全扫描/数据依赖二级扫描（Full MS/dd-MS2）模式下进行质谱分析，一级高分辨准分子离子峰定量。8 min内完成对样品中分析物的分离和高精度一级、二级扫描，得到准确质量数和准确碎片离子信息。实验结果表明，6种化合物的精确质量相对偏差均小于1×10-6，在0.5~20.0 μg/L范围内线性相关系数大于0.999，定量限为25 μg/kg，回收率在93.5%~103.5%，相对标准偏差在1.5%~7.7%，本方法具有前处理简单、快速、准确、高灵敏度、高选择性等特点，可用于保健食品中西布曲明及其衍生物等减肥类非法添加物的定性筛查和定量分析。
关键词：高效液相色谱    四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱    西布曲明    衍生物    保健食品    
Rapid screening of sibutramine and five derivatives in health food by high performance liquid chromatography-quadrupole/electrostatic orbitrap high-resolution mass spectrometry
HONG Deng, XIE Wen, HOU Jianbo, HU Xiaoli, SHI Yingzhu, LI Jie     
Zhejiang Academy of Science and Technology for Inspection and Quarantine, Hangzhou 311215, China
Foundation item: Project of Zhejiang Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau (No. ZK201709)
Abstract: A rapid screening method was developed to determine sibutramine and five derivatives in health food by high performance liquid chromatography-quadrupole/electrostatic orbitrap high-resolution mass spectrometry (HPLC-Q/Orbitrap HRMS). The sample was extracted with methanol via ultrasonic-assisted extraction coupled with high-speed centrifugation. Separation was performed on a Hypersil Gold column (100 mm×2.1 mm, 3 μm) by gradient elution with methanol/water (containing 0.15%(v/v) formic acid) as the mobile phase. The positive full mass scan/date-dependent MS2 (Full MS/dd-MS2) mode was used during MS detection, and quantification was achieved by resolution of the precursor mass. The analytes in the sample were separated, and accurate mass and MS2 fragment ions were simultaneously attained within 8 min. The results indicated that the obtained mass accuracy errors of the six analytes were less than 1×10-6. Good linearities were obtained in the range of 0.5-20.0 μg/L, and all correlation coefficients were higher than 0.999. The limits of quantification were 25 μg/kg and the recoveries were in the range of 93.5%-103.5% with relative standard deviations of 1.5%-7.7%. This simple-pretreatment, rapid, accurate, high-sensitivity, and high-selectivity method can be used in the rapid screening and quantitative analysis of sibutramine and its derivatives in health food.
Key words: high performance liquid chromatography (HPLC)     quadrupole/electrostatic orbitrap high-resolution mass spectrometry (Q/Orbitrap HRMS)     sibutramine     derivatives     health food    

西布曲明(sibutramine), 化学名为1-(4-氯苯基)-N, N-二甲基-α-(2-甲基丙基)环丁甲胺, 化学式为C17H26ClN, 白色结晶性粉末, 主要用于肥胖症的治疗, 结构式见图 1。西布曲明是一种中枢神经抑制剂, 可抑制去甲肾上腺素、5-羟色胺和多巴胺的再摄取, 长期服用可引起血压升高, 心率加快、厌食、肝功能异常、心律失常或中风等, 重者可危及生命[1, 2]。由于有增加心脏病的风险, 2010年10月以后美国、澳洲、欧盟等国已陆续废止该药品的许可证, 并令制药厂回收。2010年10月30日, 中华人民共和国国家食品药品监督管理局宣布国内停止生产、销售和使用西布曲明制剂和原料药, 撤销其批准证明文件, 已上市销售的药品由生产企业负责召回销毁。

图 1 西布曲明及其5个衍生物的化学结构式 Fig. 1 Chemical structural formulas of sibutramine and its five derivatives

2006年国家食品药品监督管理局发布了补充检验方法和检验项目批准件2006004[3], 用于检测中成药和保健食品中非法添加的西布曲明化合物, 但是不法商人为了追求产品的减肥效果, 同时为了逃避法定方法的检测, 他们改为添加新型西布曲明衍生物。苄基西布曲明、氯代西布曲明和豪莫西布曲明就是新近出现的新型西布曲明类化合物, 结构式见图 1。由于这些化合物未经临床前的安全性考察, 对人产生的不良反应未知, 其产生的危害可能更大[4]。因发现时间不长, 目前仍缺少相应的定性定量分析方法。

目前西布曲明的检测方法主要为液相色谱法(HPLC)[5-8]、液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)[9-12]和气相色谱-质谱法(GC-MS)[13], 此外也有红外光谱法[14]、表面增强拉曼光谱法[15]、离子迁移色谱法[16, 17]等报道。但这些已经报道的方法基本只检测西布曲明, 或者N-单去甲基西布曲明和N, N-双去甲基西布曲明等几种常见衍生物。胡等[18]报道了使用超高效液相色谱-三重四极杆质谱法检测食品中西布曲明及其5种衍生物的方法, 实现了保健食品中多组分的同时定性、定量分析, 满足高灵敏度检测要求, 但在检测过程中需要有目标化合物进行对照, 且不能对未知化合物进行筛查。

高效液相色谱-四极杆/静电场轨道阱高分辨率质谱(HPLC-Q/Orbitrap HRMS)能进行高通量的目标物或非目标物筛查, 能够实现高可靠性的确证和定量分析, 目前已被广泛应用于食品安全领域小分子和大分子的研究[19-23], 但尚没有使用HPLC-Q/Orbitrap HRMS对保健食品中西布曲明及其衍生物进行检测的报道。HPLC-Q/Orbitrap HRMS具有高分辨率和高选择性, 在缺少标准品的情况下根据精确分子质量及裂解规律也能进行化合物的快速筛查。本实验采用HPLC-Q/Orbitrap HRMS对保健食品中的西布曲明及其5种衍生物快速定量筛查, 并对其质谱裂解可能途径进行推测。在实际工作中可根据二级特征离子快速筛查西布曲明类物质, 再结合裂解规律推测化合物的可能结构, 从而实现对非目标化合物的筛查。

1 实验部分
1.1 仪器、试剂与材料

四极杆-静电场轨道阱高分辨质谱系统及Dionex UltiMate 3000超高效液相色谱系统(美国Thermo Fisher公司); AB204-S/A型电子天平(瑞士梅特勒公司); Elmasonic P型超声仪(德国Elma公司); 1-16K型高速离心机(德国Sigma公司); Milli-Q超纯水仪(美国Millipore公司)。

盐酸西布曲明(CAS号125494-59-9, 纯度99.9%)、盐酸N-单去甲基西布曲明(CAS号84467-947, 纯度98.8%)和盐酸N, N-双去甲基西布曲明(CAS号84484-786, 纯度98.9%)购于中国药品生物制品检定所; 盐酸苄基西布曲明(CAS号1446140-91-5, 纯度99.9%)、盐酸豪莫西布曲明(CAS号935888-80-5, 纯度98.5%)和盐酸氯代西布曲明(CAS号84485-08-5, 纯度98.7%)购于TLC Pharmachem公司。

甲醇(色谱纯, 德国Merck公司); 乙腈(色谱纯)和甲酸(LC-MS级)(西班牙Scharlau公司); 0.22 μm水系滤膜(天津津滕公司); 实验室用水为Milli-Q超纯水。

1.2 实验方法
1.2.1 色谱条件

色谱柱:Hypersil Gold (100 mm×2.1 mm, 3 μm, 美国Thermo Fisher Scientific公司); 流动相A为0.15%(v/v)甲酸水溶液, B为甲醇, 梯度洗脱程序:0~2.0 min, 70%A~5%A; 2.0~6.0 min, 5%A; 6.0~6.2 min, 5%A~70%A; 6.2~8.0 min, 70%A; 流速:0.3 mL/min; 进样量5 μL; 柱温25 ℃。

1.2.2 质谱条件

加热电喷雾离子源(HESI); 正离子模式; 离子源温度350 ℃; 毛细管温度320 ℃; 喷雾电压3 500 V; 辅助气:15 arb; 鞘气:40 arb; 扫描模式:正离子全扫描/数据依赖二级扫描(Full MS/dd-MS2); Full MS分辨率(R)70 000, Orbitrap最大容量(AGC target) 1×106, Orbitrap最大注入时间100 ms, 质量扫描范围m/z 200~350;dd-MS2分辨率17 500, Orbitrap最大容量1×105, Orbitrap最大注入时间50 ms; 归一化碰撞能量(NCE): 30。各个化合物的质谱分析参数见表 1。

表 1 6种分析物的质谱分析参数 Table 1 Mass spectrometric parameters of the six analytes
1.2.3 标准溶液的配制

分别精密称取固体标准品适量, 加甲醇制成目标物质量浓度为1 g/L的标准储备液; 再经梯度稀释成质量浓度分别为0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0 μg/L的混合标准工作溶液, 于4 ℃冰箱贮存。

1.2.4 样品前处理

取保健品片剂、胶囊或颗粒, 研细, 准确称取1.0 g样品, 置于50 mL容量瓶中, 加入适量甲醇, 超声提取15 min, 冷却至室温后加甲醇定容, 高速离心5 min后, 经0.22 μm滤膜后待上机检测。

2 结果与讨论
2.1 色谱柱与色谱条件的优化

分别考察了Agilent Zorbax SB-C18(150 mm×2.1 mm, 3 μm)和Hypersil Gold (100 mm×2.1 mm, 3 μm)2种类型的色谱柱对6种目标物的分离效果, 优化流动相后Zorbax SB-C18色谱柱在10 min以后出峰, 而Hypersil Gold色谱柱在4 min左右出峰, 具有出峰早、分离周期短、分离效率更高的优点, 故本研究采用Hypersil Gold色谱柱进行分离。

为了获得良好的分离效果和峰形, 我们对流动相进行了考察。比较水-甲醇、水-乙腈、0.15%(v/v)甲酸水溶液-甲醇、0.15%(v/v)甲酸水溶液-乙腈作为流动相的分离效果。由于西布曲明类均为含N化合物, 其易得到一个质子形成[M+H]+准分子离子峰, 加入甲酸能够明显改善目标化合物的峰形。甲醇的分离效果略优于乙腈, 且同等浓度下具有更大的响应强度。从提取离子色谱图上看, 该6种组分没有实现基线分离, 但是其m/z完全不同, 不影响其识别、确证和定量, 因此最终确定0.15%(v/v)甲酸水溶液-甲醇体系为最佳流动相体系。图 2为加标水平为100 μg/kg的西布曲明及其5个衍生物的一级分子离子峰提取离子色谱图。

图 2 加标水平100 μg/kg的西布曲明及其5个衍生物的提取离子色谱图 Fig. 2 Extracted ion chromatograms of sibutramine and its five derivatives at a spiked level of 100 μg/kg
2.2 线性方程、检出限与定量限

将西布曲明及其5种衍生物的系列混合标准溶液按上述色谱及质谱条件进行测定, 以各物质的一级高分辨准分子离子峰的色谱峰面积(y)对各物质的质量浓度(x)绘制标准曲线, 求得回归方程和相关系数。所有的化合物在合适的浓度范围内线性关系良好, 相关系数大于0.999。在空白的保健品样品基质中添加低浓度的目标化合物, 以3倍信噪比(S/N=3)时对应的含量为该化合物的检出限(LOD), 以10倍信噪比(S/N=10)时对应的含量为方法的定量限(LOQ), 结果见表 2。

表 2 各个化合物的线性方程、相关系数、检出限和定量限 Table 2 Linear equation, correlation coefficient (R2), limit of detection (LOD),and limit of quantification (LOQ) of each compound
2.3 回收率与精密度

采用分别在空白的固体类保健食品和液体类保健食品中添加标准溶液的方法进行添加回收率测定和方法的精密度测定, 添加水平分别为25、100和500 μg/kg, 每个浓度水平平行测定6次, 测得这6种化合物的回收率范围为93.5%~103.5%, 相对标准偏差(RSD, n=6)范围为1.5%~7.7%, 该法的回收率和精密度符合实验室质量控制规范[24]要求, 能够满足不同剂型样品的分析要求, 可用于日常分析的检测。回收率和精密度试验结果见表 3。

表 3 西布曲明及其衍生物的加标回收率及精密度(n=6) Table 3 Spiked recoveries and precisions of sibutramine and its derivatives (n=6)
2.4 裂解规律的推测及应用

基于西布曲明的二级特征离子质谱图(见图 3), 推测西布曲明可能的裂解途径(见图 4):先脱去中性二甲胺分子形成m/z 235.124 80的碎片, 一方面通过1, 3-氢迁移后脱去异丁烯, 形成m/z 179.062 20离 子碎片, 另一方面脱去异戊烯, 形成m/z 165.046 55的四元环正离子碎片。四元环开环以后形成稳定的153.046 55、139.030 90、m/z 125.015 25的特征碎片。m/z为125.015 25的苄基正离子是质谱碎片中的基峰。

图 3 西布曲明的二级特征离子质谱图 Fig. 3 Secondary characteristic ion mass spectrum of sibutramine

图 4 西布曲明及其衍生物可能的裂解途径 Fig. 4 Possible fragmentation pathways of sibutramine and its derivatives

N-单去甲基西布曲明, N, N-双去甲基西布曲明和豪莫西布曲明这3个衍生物的裂解方式与西布曲明相似。苄基西布曲明脱去二甲胺形成m/z 269.109 15碎片后, 更容易发生1, 2-氢迁移形成稳定的m/z 91.054 23苄基特征离子碎片, 然后发生和西布曲明一样的裂解过程。

西布曲明苯环上的一个氢被氯原子取代即得到氯代西布曲明, 其准分子离子峰的m/z比西布曲明的大34, 同时其多级特征碎片离子(m/z 158.976 28, 172.991 93, 187.007 58)均比西布曲明的特征碎片离子大34, 与其准分子离子峰差值相同, 说明脱去的碎片为它们结构中相同的部分, 氯代西布曲明裂解方式与西布曲明相同。

高分辨质谱检测器具有高分辨率和高选择性, 在缺少标准品的情况下根据精确分子质量及裂解规律也能进行化合物的快速筛查。通过对6种化合物的质谱裂解方式进行探索, 根据西布曲明的裂解规律可推测在裂解过程中均能产生m/z分别为125.015 25和139.030 90这两个二级特征碎片离子, 在实际工作中可根据这两个特征离子快速筛查西布曲明类物质, 再结合裂解规律推测化合物的可能结构, 从而实现对非目标化合物的筛查。

2.5 实际样品的测试

应用所建立的快速筛选方法对60种国内外常见的减肥类保健食品中的西布曲明及其5种衍生物进行检测。其中4种保健食品中检出西布曲明成分, 含量分别为56.8 mg/kg、73 150 mg/kg、73 450 mg/kg和88 900 mg/kg; 2种样品中检出N-单去甲基西布曲明成分, 含量分别为47.4 mg/kg和60.2 mg/kg；2种样品中检出N, N-双去甲基西布曲明成分, 含量分别为5.35 mg/kg和5.93 mg/kg。可见减肥类保健食品中西布曲明及其衍生物的非法添加现象存在。

3 结论

本实验利用高效液相色谱-四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱联用系统建立了减肥类保健食品中西布曲明及其5种衍生物的快速筛查和定量分析方法。依靠一级高分辨准分子离子峰定量, 二级特征离子定性, 6种化合物的精确质量相对偏差均小于1×10-6。文中还对6种化合物的质谱裂解方式进行了探索。研究结果表明本方法具有前处理简单、快速、准确、高灵敏度、高选择性等特点, 能够满足保健食品中西布曲明及其衍生物等减肥类非法添加物的快速筛选分析需要。

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