磁性双功能材料的制备及用于血清中外泌体的捕获和磷肽富集

doi:10.3724/SP.J.1123.2025.04034

摘要/Abstract

摘要：

作为临床样本，血清因其易于获取等优势被广泛应用于疾病研究。血清中的外泌体不仅携带多种蛋白质、核酸等生物活性物质，还可以参与细胞之间的通讯，与多种疾病的发生发展相关联。作为关键的翻译后修饰之一，蛋白质磷酸化通过动态调控细胞信号网络参与疾病发生发展，其在外泌体中的特异性表达为疾病诊断提供了新视角。本论文设计制备了一种基于2-三氟甲基-4-氨基苯甲酸和Ti⁴⁺的磁性双功能材料（MagphTi⁴⁺），通过2-三氟甲基-4-氨基苯甲酸的疏水作用和Ti⁴⁺的静电作用共同锚定外泌体的双层膜，通过基质的磁响应性质实现外泌体的分离提取。同时，利用材料表面的Ti⁴⁺和磷酸根的螯合作用实现磷肽的富集。通过冷场发射扫描电子显微镜、热重分析、红外光谱、X射线光电子能谱和Zeta电位测定对MagphTi⁴⁺进行了表征。通过冷场发射扫描电子显微镜、透射电子显微镜和十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳对外泌体进行了表征，验证了MagphTi⁴⁺对外泌体精准识别和快速分离的能力。以β-酪蛋白酶解物为标准磷肽模型，建立了磁性固相萃取（MSPE）-质谱检测技术平台，实现了MagphTi⁴⁺对磷肽的高选择性（β-酪蛋白与牛血清白蛋白的质量比为1∶5 000）和高灵敏度的检测（检出限低至0.4 fmol/μL）。将该方法用于实际样品分析，实现了对血清外泌体的提取与低丰度磷肽的分离富集。本方法有望用于临床血清样本中外泌体的高通量磷酸化蛋白质组学分析和疾病标志物的筛查。

关键词: 血清外泌体, 钛离子, 磁性固相萃取, 磷肽, 质谱检测

Abstract:

As a clinical sample， serum is widely used in disease research due to the minimally invasive nature of its collection and easy accessibility. Exosomes in serum not only carry various bioactive substances such as proteins and nucleic acids but also participate in intercellular communication， which is closely associated with the development of multiple diseases. As one of the most critical post-translational modifications， protein phosphorylation dynamically regulates cellular signaling networks and participates in disease pathogenesis. However， due to the low abundance of exosomes in serum and the fact that phosphoproteins constitute only 1%–2% of the total proteome， direct analysis of exosomal phosphoproteins from serum faces significant challenges. The specific expression of phosphoproteins in exosomes provides novel perspectives for disease diagnosis. In this study， magnetic bifunctional nanoparticles （MagphTi⁴⁺） based on 2-trifluoromethyl-4-aminobenzoic acid and Ti⁴⁺ were synthesized， which anchor the exosome bilayer membrane through the hydrophobic interactions of 2-trifluoromethyl-4-aminobenzoic acid and the electrostatic interactions of Ti⁴⁺， and the magnetic responsiveness ensures the isolation of exosomes. Simultaneously， the enrichment of phosphopeptides was achieved by the chelation between Ti⁴⁺ and phosphate groups. MagphTi⁴⁺ was characterized by cold field scanning electron microscopy， thermogravimetric analysis， Fourier transform infrared spectroscopy， X-ray photoelectron spectroscopy and zeta potential measurement， demonstrating the successful synthesis and functional characteristics of MagphTi⁴⁺. The precise recognition and rapid separation of exosomes were validated by cold field scanning electron microscopy， transmission electron microscopy and sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis. Using β-casein as a standard phosphoprotein model， a magnetic solid-phase extraction （MSPE）-matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry platform was established， which demonstrated high selectivity （mass ratio of β-casein to bovine serum albumin was 1∶5 000） and sensitivity （detection limit was 0.4 fmol/μL） for phosphopeptide detection. Subsequently， the method was applied to saliva and nonfat milk samples； 11 phosphopeptides were identified in saliva and 20 were identified in nonfat milk， which demonstrates excellent enrichment capability for phosphopeptide detection in real samples. When applied to clinical serum samples， the method successfully achieved the extraction of exosomes in serum and enrichment of phosphopeptides with low abundance. This integrated approach provides a powerful tool for exosome capture and phosphopeptide enrichment from complex biological samples， showing significant potential for high-throughput phosphoproteomic analysis of exosomes from clinical serum and the screening of disease biomarkers. Further application of the method developed in this study holds promise for elucidating the mechanisms of exosome-mediated intercellular transmission of phosphorylation signaling， thereby identifying novel targets related to tumor metastasis and immune escape.

Key words: serum exosomes, titanium ion, magnetic solid-phase extraction, phosphopeptides, mass spectrometric detection

中图分类号:

O658

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图/表 13

图1 MagphTi4+的（a）合成路线及其（b）富集磷肽的过程

Fig. 1 （a） Synthetic route of MagphTi4+ and （b） workflow of phosphopeptides enrichment by MagphTi4+ TEOS： tetraethyl orthosilicate； APTES： 3-aminopropyltriethoxysilane； EDC： 1-ethyl-3-（3′-dimethylaminopropyl） carbodiimide； NHS： N-hydroxysuccinimide.

图2 （a）Fe3O4和（b）MagphTi??的SEM图像

Fig. 2 SEM images of （a） Fe3O4 and （b） MagphTi??

图3 Fe3O4， Fe3O4-NH2和MagphTi4+的表征

Fig. 3 Characterization of Fe3O4， Fe3O4-NH2 and MagphTi4+a. FTIR spectra； b. Zeta potentials； c. TGA curves； d. XPS curves.

图4 β-酪蛋白酶解液的MALDI质谱图

Fig. 4 MALDI mass spectra of β-casein digestsa. direct analysis； b-d. analysis after enrichment with different loading buffers：（b） 50%ACN+49%H2O+1%TFA；（c） 70%ACN+29%H2O+1%TFA；（d） 70%ACN+29.9%H2O+0.1%TFA.

图5 MagphTi4+富集后 β-酪蛋白酶解液的MALDI质谱图

Fig. 5 MALDI mass spectra of β-casein digests after enrichment by MagphTi4+Concentrations of β-casein digests： a. 40 fmol/μL； b. 4 fmol/μL； c. 0.4 fmol/μL.

表 1 不同材料对磷肽富集后的分析结果

Table 1 Analysis results of phosphopeptides after enrichment by different materials

Material	LOD/（fmol/μL）	Selectivity （β-casein∶BSA， mass ratio）	Ref.
GO@PEI@CS@Ti⁴⁺	5	1∶100	［38］
SPIOs@PVP-PEI@MOF@Arg	10	1∶1000	［39］
Fe₃O₄@GO@PEI@Ti⁴⁺	2.5	1∶1000	［40］
Fe₃O₄@ILI-01@Ti⁴⁺	0.5	1∶1000	［41］
Fe₃O₄@UiO-66-NH₂-Zr⁴⁺ HFs	1.0	1∶200	［42］
MagphTi⁴⁺	0.4	1∶5000	this work

图6 （a，b）混合样品和（c，d） β-酪蛋白酶解液的质谱图

Fig. 6 Mass spectra of （a， b） mixed samples and （c， d） β-casein digestsa. direct analysis； b. analysis after enrichment by MagphTi4+； c and d. analysis after enrichment by MagphTi4+ for （c） the first time and （d） the sixth time.

图7 （a，b）唾液样品和（c，d）脱脂牛奶样品的质谱图

Fig. 7 Mass spectra of （a， b） saliva samples and （c， d） nonfat milk samplesa， c. direct analysis； b， d. analysis after enrichment by MagphTi4+. p in Fig. （b） and （d） represents phosphopeptide.

表 2 经MagphTi4+富集后唾液样品中的磷肽

Table 2 Phosphopeptides obtained from saliva samples after enrichment by MagphTi4+

No.	m/z	Peptide sequence
1	998.06	ssEEKFL
2	1159.15	ssEEKFLR
3	1187.70	DsSEEKFLR
4	1231.64	SsEEKFLRR
5	1270.75	DssEEKFLR
6	1305.53	GPPPQGDKsRSP
7	1424.19	DssEEKFLRR
8	1589.70	GGDsEQFLDEERQ
9	1703.96	DGGDsEQFLDEERQ
10	1731.92	GPPAQGGsKSQSARAPPG
11	2003.99	VISDGGDsEQFIDEERQ

表 3 经MagphTi4+富集后脱脂牛奶样品中的磷肽

Table 3 Phosphopeptides obtained from nonfat milk samples after enrichment by MagphTi4+

No.	m/z	Peptide sequence
α1	1237.50	TVDMEsTEVF
α2	1267.92	YLGYLEQLLR
α3	1337.70	HIQKEDVsER
α4	1466.86	TVDMEsTEVFIK
α5	1660.79	VPQLEIVPNsAEER
α6	1759.75	HQGLPQEVLNENLLR
α7	1832.73	YLGEYLIVPNsAEER
α8	1847.82	DIGSEsTEDQAMEDIK
α9	1927.56	DIGsEsTEDQAMEDIK
α10	1943.79	DIGsEsTEDQAMoEDIK
α11	1952.68	YKVPQLEIVPNsAEER
α12	2619.25	NTMEHVsssEESIIsQETYK
α13	2678.23	VNELsKDIGsEsTEDQAMEDIK
α14	2704.06	QMEAEsIsssEEIVPNsVEA
α15	2720.89	QMEAEsIsssEEIVPNPNsVE
α16	2935.24	EKVNELsKDIGsEsTEDQAMEDI
β1	2062.14	FQsEEQQQTEDELQDK
β2	2556.46	FQsEEQQQTEDELQDKIHPF
β3	2965.98	ELEELNVPGEIVEsLsssEESI
β4	3122.68	RELEELNVPGEIVEsLsssEESI

图8 （a，b）对提取的外泌体的表征和（c，d）血清外泌体样品的质谱图

Fig. 8 （a， b） Characterization of isolated exosomes and （c， d） mass spectra of exosomes in serum samplesa. SEM images； b. TEM images； c. direct analysis； d. analysis after enrichment by MagphTi4+.

图9 十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳结果（考马斯亮蓝染色）

Fig. 9 Results of sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis （stained with Coomassie blue）

表 4 经MagphTi4+富集后血清内外泌体中的磷肽

Table 4 Phosphopeptides obtained from exosomes in serum after enrichment by MagphTi4+

No.	m/z	Peptide sequence
1	1389.92	DsGEGDFLAEGGGV
2	1460.01	ADsGEGDFLAEGGGV
3	1545.06	DsGEGDFLAEGGGVR
4	1616.11	ADsGEGDFLAEGGGVR

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