色谱

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第40卷第3期目次

2022, 40 (3): 0-0.

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微流控芯片系统在循环肿瘤细胞分离检测中的应用进展

曹荣凯, 张敏, 于浩, 秦建华

2022, 40 (3): 213-223. DOI: 10.3724/SP.J.1123.2021.07009

摘要 ( 294 )

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循环肿瘤细胞(CTCs)的分离分析一直是肿瘤相关研究中的热点方向,作为液体活检的重要标志物之一,其在外周血中的含量与癌症病发状况密切相关。然而人体血液中CTCs的含量非常低,通常来说仅有0~10个/mL,因此在开展临床血液样本中CTCs的检测前,往往需要对样本进行前处理,以实现CTCs的分离和富集。微流控芯片技术凭借样品消耗少,分离效率高,易于自动化和集成化等特点,在CTCs分离分析研究中具有诸多优势。近年来,利用微流控芯片开展CTCs分离检测的研究进展迅速,多种技术原理和检测方法相继出现。从技术原理角度进行区分,可分为生物亲和法和物理筛选法。生物亲和法主要依赖抗原抗体相互作用,或核酸适配体与靶标的特异性结合,该方法选择性高,但效率和捕获率偏低。物理筛选法则主要依据细胞本身的物理性质,诸如尺寸、密度和介电性质等差异实现分离。例如,可通过芯片微结构对CTCs进行阻隔或捕获,通过外加物理场(声、电、磁)辅助分选,也可以利用微观尺度流体力学作用对混合细胞进行筛分。物理筛选法一般通量较高,但往往分离纯度较低。同时,利用微流控芯片的集成优势将两种方法相结合,往往能得到更好的分离效果。除了以CTCs作为直接目标的正向富集外,还可以采取反向富集的策略,通过将作为干扰项的白细胞等作为靶标进行选择性地去除,可以避免直接筛选方式对CTCs细胞活性产生的影响。该文概述性介绍了利用微流控芯片开展循环肿瘤细胞分离检测的技术原理、芯片原位检测方法和研究进展,并结合现阶段存在的问题对其未来发展趋势予以展望。

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基于镜像酶正交酶切的蛋白质复合物规模化精准分析新方法

韩若楠, 赵丽丽, 安雨馨, 梁振, 赵群, 张丽华, 张玉奎

2022, 40 (3): 224-233. DOI: 10.3724/SP.J.1123.2021.06010

摘要 ( 116 )

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蛋白质主要以复合物的形式参与各项生命活动。化学交联质谱(CXMS)技术作为近年来新兴的蛋白质复合物解析技术,不仅可实现蛋白质复合物规模化解析,而且普遍适用于任意相对分子质量和纯度的蛋白质复合物样品,因此已成为X-射线晶体衍射技术、冷冻电镜技术等蛋白质复合物解析经典技术的重要补充。目前,CXMS主要采用胰蛋白酶将交联后的蛋白质复合物进行酶切,并进行质谱鉴定。然而鉴定到的交联肽段谱图中b/y特征碎片离子的鉴定数目不足,且因肽段序列匹配连续性较差导致谱图可信度相对较低,影响了蛋白质复合物交联位点的鉴定精准度。该文基于镜像酶正交切割的互补特性,采用胰蛋白酶镜像酶与胰蛋白酶联合酶切的方法,对交联后的蛋白质复合物分别进行酶切,再利用液相色谱-质谱联用技术对酶解产生的交联肽段进行鉴定,进而实现蛋白质复合物的组成、相互作用和结构位点距离约束的解析。对牛血清白蛋白和大肠杆菌全蛋白的交联肽段的分析结果表明,该方法通过增加交联肽段谱图中特征碎裂离子的数目和连续性,鉴定到的大肠杆菌全蛋白的交联位点,较单一胰蛋白酶酶切,提高了16%。因此,镜像酶正交酶切策略能有效提高交联肽段的鉴定准确度和覆盖度,有望为实现规模化的蛋白质复合物精准解析提供新思路。

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改性松香键合二氧化硅高效液相色谱固定相的制备及其对三七总皂苷的分离

谢文博, 夏璐, 李浩, 李文, 曹宇, 黄云, 雷福厚

2022, 40 (3): 234-241. DOI: 10.3724/SP.J.1123.2021.07008

摘要 ( 104 )

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三七中发挥药效的主要成分为三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1和人参皂苷Rd,用于贫血、冠心病、高血压、脑卒中后遗症等疾病的治疗,但其化学成分多且难分离。将氢化松香丙烯酸羟乙酯(HRHA)通过巯基-烯点击化学反应键合到烷基化硅胶表面,制备出一种新型的改性松香键合二氧化硅高效液相色谱固定相(SiO₂@HRHA),用于三七总皂苷的分离。对色谱固定相进行一系列表征,表明SiO₂@HRHA固定相具有球形度好和表面多孔的特点,比表面积为308.55 m²/g,平均孔径达到6.78 nm。将制备的固定相湿法装柱,色谱柱性能评价结果表明,SiO₂@HRHA柱具备反相色谱行为、较好的流通性及重复性。从色谱柱的综合评价Tanaka测试可知,SiO₂@HRHA柱具有较好的立体选择性及氢键容量。将其用于三七总皂苷的分离,SiO₂@HRHA柱在一定程度上优于C18柱,而SiO₂@HRHA柱的分离效果又优于实验室同期合成的色谱柱,对5种皂苷(R1、Rg1、Re、Rb1和Rd)的分离度依次为3.33、3.54、20.17和9.72,表明SiO₂@HRHA高效液相色谱柱对三七总皂苷具有优异的分离效果,为从实际样品中分离纯化三七总皂苷提供了新思路。

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超高效液相色谱-高分辨质谱联用结合整合过滤策略全面分析茶树花中化学成分

黄斯晨, 赵宏朋, 胡永丹, 任达兵, 易伦朝

2022, 40 (3): 242-252. DOI: 10.3724/SP.J.1123.2021.07015

摘要 ( 197 )

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茶树花与茶鲜叶同为茶树的生物产出,但茶树花往往被视为茶叶生产过程中的废物被舍弃,造成了茶树花资源的极大浪费。目前对于茶树花中化学成分的分析主要集中在氨基酸、茶多酚等单一类型化学成分上,对于茶树花中多类化学成分的同时分析仍鲜见报道。研究者对于茶树花中所含化学成分的种类和含量不完全清楚,成为制约茶树花深度开发与利用的重要原因。该研究采用超高效液相色谱-高分辨质谱联用技术(UPLC-HRMS)对茶树花中的化学成分进行检测,结合氮规则过滤(NRF)、质量亏损过滤(MDF)和诊断碎片离子过滤(DFIF)的整合过滤策略(IFS)筛选目标化学成分的特征质谱,并利用化学成分的色谱保留时间、一级质谱、二级质谱等信息对化学成分进行定性分析。共定性出茶树花中6大类共137种化学成分,包括3种生物碱、38种黄酮、31种酚酸及其衍生物、37种儿茶素及其衍生物、18种氨基酸以及10种其他类成分。采用内标法对所有定性出的137种化学成分进行定量分析,结果表明,茶树花中6类化学成分含量从高到低依次为氨基酸(9371.42 μg/g)、儿茶素及其衍生物(9068.43 μg/g)、酚酸及其衍生物(8696.92 μg/g)、生物碱(4392.52 μg/g)、黄酮(1192.88 μg/g)、其他类成分(139.94 μg/g)。该研究采用质量控制样本评价仪器的稳定性和检测数据的重复性,9种代表性化学成分的相对标准偏差在2.11%~12.17%范围内,表明仪器的稳定性和检测数据重复性良好。同时,选取绿原酸类成分以及糖基化槲皮素类成分作为代表性成分,说明了整合过滤策略提取目标类型化学成分的全过程。该研究全面揭示了茶树花中化学成分的种类和含量,可为茶树花的深度开发和利用提供有价值的信息和数据参考。

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超高效液相色谱-静电场轨道阱高分辨质谱快速筛查和确证凉茶中167种非法添加药物

何嘉雯, 温家欣, 刘亚雄, 胡佳哲, 曹雅静, 赖宇红

2022, 40 (3): 253-265. DOI: 10.3724/SP.J.1123.2021.07006

摘要 ( 178 )

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基于质谱数据库,建立了超高效液相色谱-静电场轨道阱高分辨质谱(UHPLC-Orbitrap HRMS)快速筛查和确证凉茶中167种非法添加药物的方法。通过调研,选定了解热镇痛药、糖皮质激素、抗菌药、抗组胺药等167种药物,并利用Orbitrap HRMS和TraceFinder软件采集和记录每种药物的信息,建立高分辨质谱数据库。样品以50%(v/v)甲醇水溶液超声提取。样品溶液采用Waters XBrigde BEH C18色谱柱(100 mm×2.1 mm, 2.5 μm)分离,0.1%(v/v)甲酸水溶液-0.1%(v/v)甲酸乙腈溶液梯度洗脱。Orbitrap HRMS以全扫描/数据依赖二级质谱扫描(Full MS/dd-MS²)模式,正、负离子同时切换采集数据。将样品数据导入TraceFinder软件,以母离子精确质量数、保留时间、碎片离子精确质量数等进行数据库自动筛查。若某成分的母离子精确质量数实测值与理论值偏差小于5×10^-6,保留时间偏差小于20 s,至少一个碎片离子精确质量数实测值与理论值偏差小于5×10^-6,且二级质谱与数据库收录谱图相似,可判定该成分检出。结果表明,方法特异性好,各成分线性关系良好,相关系数(r)大于0.99。培氟沙星等5种成分存在本底干扰,不宜采用该法进行定量,其余162种成分回收率为66.4%~118.1%,精密度RSD (n=6)为0.1%~16.1%。方法在0.2 mg/kg下可筛查83种成分,1.0 mg/kg下可筛查167种成分。方法应用于245批样品,检出12批问题样品,阳性成分有对乙酰氨基酚、双氯芬酸钠、氯苯那敏等,并检出标准方法外成分金刚烷胺、右美沙芬、溴苯那敏和环丙沙星。方法检测速度快,分析成分多,筛查结果准确,为凉茶非法添加药物高通量筛查提供了新的技术支撑。

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超高效液相色谱-静电场轨道阱高分辨质谱法测定硝苯地平中痕量基因毒性杂质

郭常川, 谭会洁, 刘琦, 巩腾飞, 王雪, 王程霖, 徐玉文

2022, 40 (3): 266-272. DOI: 10.3724/SP.J.1123.2021.06008

摘要 ( 140 )

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建立了测定硝苯地平中基因毒性杂质2、6和12的超高效液相色谱-静电场轨道阱高分辨质谱法(UHPLC-Orbitrap HRMS)。样品以甲醇为溶剂,提取后直接进样分析。采用ACE EXCEL^TM 3 C18-AR色谱柱(150 mm×4.6 mm, 3 μm)分离,流动相为甲醇-0.1%甲酸水(65∶35, v/v),等度洗脱。质谱部分采用电喷雾电离(ESI)源。采用正离子平行反应监测(PRM)扫描模式,质谱分辨率为35000 FWHM,杂质2、6、12的[M+H]⁺母离子准确质量数分别为m/z 347.1230、361.1026、347.1230,提取[M+H]⁺碎片离子准确质量数分别为m/z 315.0968、298.1069、315.0968,归一化碰撞能量(NCE)分别为10%、42%、10%,外标法定量。对方法进行了详细的方法学验证,结果表明,该法专属性良好,溶剂对杂质测定无干扰;杂质2、6、12质量浓度与其峰面积在0.2~100 ng/mL范围内呈现良好的线性关系,相关系数(r)均≥0.9998;杂质2、6、12在低、中、高3个水平下的回收率为96.9%~105.0%, RSD为1.21%~5.12%,检出限均为0.05 ng/mL,定量限均为0.2 ng/mL。应用该方法对3批硝苯地平样品中的杂质2、6、12进行测定,3批样品均未检出杂质6,但均检出杂质2和杂质12,其检出量未超过限度。该方法灵敏、快速、准确,操作简便,可为药企对硝苯地平的质量控制提供参考,并为药监部门的监管提供有力的技术支持。

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高效液相色谱-串联质谱法快速同时测定土壤中草甘膦、草铵膦及其代谢物

平华, 赵芳, 李成, 王北洪, 孔红玲, 李杨, 马智宏

2022, 40 (3): 273-280. DOI: 10.3724/SP.J.1123.2021.08005

摘要 ( 456 )

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建立了快速同时测定土壤中草甘膦(GLY)、草铵膦(GLUF)及其代谢物的高效液相色谱-串联质谱(HPLC-MS/MS)分析方法。分别对前处理和色谱-质谱条件进行优化,样品采用0.5 mol/L氨水作为溶剂振荡提取,离心,上清液过滤膜后,直接采用HPLC-MS/MS测定,电喷雾离子源(ESI^-),多反应监测(MRM)模式下检测,外标法定量。结果表明,采用Dikma Polyamino HILIC色谱柱(150 mm×2.0 mm, 5 μm)进行分离,目标化合物峰形良好,响应值高。GLY及其代谢物氨甲基膦酸(AMPA)在5.0~500 μg/L范围内线性关系良好;GLUF及其代谢物N-乙酰基-草铵膦(NAG)、3-(甲基膦基)丙酸(MPP)在2.0~500 μg/L范围内线性关系良好;5种化合物的相关系数(r²)均大于0.998,可以满足定量分析的要求。GLY、GLUF及其代谢物的方法检出限(LOD)在2.0~4.0 μg/kg之间,方法定量限(LOQ)在6.7~13.3 μg/kg之间。在空白土壤样品中添加0.02、0.05、0.2 mg/kg 3个水平的5种化合物混合标准溶液考察回收率,结果表明,低有机质含量土壤中5种化合物的平均加标回收率在74.2%~101%之间,相对标准偏差(RSD)在0.93%~6.8%之间;高有机质含量土壤中5种化合物的平均加标回收率在90.8%~116%之间,RSD在0.40%~7.1%之间。采用建立的方法对实际土壤样品进行测定,AMPA、GLY、MPP、GLUF、NAG的检出率分别为45%、25%、10%、5%和5%,最大残留量分别为147、35.2、154、21.6和11.0 μg/kg,说明土壤中GLY、GLUF及其代谢物残留需要引起一定的关注。该方法简化了前处理步骤,具有简单、快速、绿色环保、成本低、准确度和灵敏度高、重现性好等优点,适用于大批量不同有机质含量土壤样品的检测,为研究其在土壤中的残留状况和环境行为提供了可靠的技术支持。

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基于随机扩散理论的气相色谱分离模拟

孙寅璐, 王琳, 银芷玉, 赵健伟

2022, 40 (3): 281-288. DOI: 10.3724/SP.J.1123.2021.10011

摘要 ( 98 )

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色谱分离过程中的粒子扩散问题是色谱动力学研究的基础,深入理解粒子的扩散行为对优化分离操作条件、提升色谱性能和开发新型色谱柱尤为关键。现有的模拟方法多集中于局部过程的热力学研究,而整体的扩散分离过程报道并不多见。为此,该文基于微尺度受限空间内随机扩散的方法,通过动态追踪粒子的运动轨迹,实现粒子在气相色谱开管柱内的扩散全过程模拟。基于前期烷烃同系物的分离模拟研究,结合Kovats保留指数,分别建立了吸附步数与温度、吸附步数与碳数的函数关系,由此获得不同类型的同系物在不同温度条件下的分离参数系统。以醇类同系物的分离验证模拟的可靠性,结果表明保留时间的相对误差基本控制在5%以内,而峰宽相对误差在0.75%~60%之间。峰宽误差较大的原因在于:(1)参数化计算过程中未能充分迭代以及使用外推法;(2)模型中忽略了醇分子之间的氢键作用。该文提出的模拟方法虽然可以准确地预测色谱保留时间以及合理描述色谱峰的基本形貌特征,但尚有进一步发展空间,特别是增加对分子间相互作用的细节处理,例如可参考分子力学的方法建立分子间势函数和吸附步数的关系,利用分子力学计算的能量来取代参数化的吸附步数,从而实现更为精确的分离过程模拟。总体而言,该文所提出的模拟方法为优化色谱分离操作条件和开发新型色谱分离技术提供了有价值的参考。

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基于场放大进样和石墨烯量子点双重富集毛细管电泳分离检测三聚氰胺和双氰胺

李超, 王琪, 张召香

2022, 40 (3): 289-295. DOI: 10.3724/SP.J.1123.2021.08017

摘要 ( 85 )

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通过热解法制备了硫掺杂的石墨烯量子点(S-GQDs),同石墨烯量子点(GQDs)相比,S原子的引入有效改善了GQDs的表面状态和化学特性、增强其对正电荷的捕获能力,使其更易与阳离子相互作用。以S-GQDs为载体,结合电堆积富集技术,发展了一种基于场放大进样(FASI)和S-GQDs放大的双重富集毛细管电泳(CE)分离检测三聚氰胺和双氰胺的方法。三聚氰胺和双氰胺在酸性介质中带正电荷,电动进样时快速迁移到毛细管入口端进行FASI预富集;同时带负电荷的S-GQDs向阳极端迁移,在样品与缓冲溶液的界面处通过静电作用吸附样品离子,S-GQDs作为载体使检测信号进一步放大。实验考察了缓冲溶液中S-GQDs的体积分数、缓冲溶液的组成及pH、进样时间等因素对富集分离效果的影响。当缓冲溶液的pH为4.6时,进样时间可延长至450 s。同常规电动进样(10 kV×10 s)相比,采用FASI与S-GQDs双重放大技术可使检测灵敏度提高1.6×10⁵倍。该方法对三聚氰胺和双氰胺检测的线性范围是1.0×10^-14~1.0×10^-8mol/L,相关系数(r²)大于0.999,检出限分别为2.6×10^-15和5.7×10^-15mol/L。实现了对盐酸二甲双胍中三聚氰胺和双氰胺的高灵敏检测,回收率分别为95.9%~102.4%和92.0%~106.0%,相对标准偏差(RSD)小于5%。该方法操作简单,分离效果好,准确度高,重现性好,适用于分离检测不同盐酸二甲双胍制剂中的三聚氰胺和双氰胺。

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直链淀粉-三[(S)-1-苯乙基氨基甲酸酯]手性固定相拆分布地奈德对映体及其制剂含量的测定

黄永鹏, 唐慧, 孟祥燕, 陈博, 钟辉, 邹志云

2022, 40 (3): 296-301. DOI: 10.3724/SP.J.1123.2021.06048

摘要 ( 107 )

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22R-布地奈德的药物活性比22S-布地奈德的强2~3倍,开发布地奈德对映体拆分和定量分析方法,可为其药物研发及质量控制提供重要依据。目前,主要以反相C₁₈固定相对布地奈德对映体进行拆分,而采用手性固定相对其进行拆分少有报道。通过考察固定相、流动相和柱温对布地奈德对映体拆分的影响,建立了基于直链淀粉-三[(S)-1-苯乙基氨基甲酸酯]手性固定相快速拆分和检测布地奈德对映体的高效液相色谱方法,其色谱条件如下:色谱柱为Chiralpak AS-RH色谱柱(150 mm×4.6 mm, 5.0 μm),流动相为乙腈-水(45∶55, v/v),柱温40 ℃,流速1.0 mL/min,二极管阵列检测器(DAD),检测波长246 nm,进样量10 μL。在该色谱条件下,布地奈德的两个对映体得到较好拆分,22R-布地奈德和22S-布地奈德的保留时间分别6.40 min和7.77 min,分离度为4.64; 22R-布地奈德和22S-布地奈德分别在各自范围内线性关系良好,相关系数(R²)均为0.9999,检出限分别为0.05 μg/mL和0.07 μg/mL,定量限分别为0.16 μg/mL和0.20 μg/mL; 4个添加水平的样品加标回收率为102.63%~104.17%,相对标准偏差(RSD)为0.08%~0.57%(n=6)。将该方法应用于1批次4个吸入用布地奈德混悬液实际样品进行检测,22R-布地奈德和22S-布地奈德的含量分别为283.15~284.63 μg/mL和259.86~261.51 μg/mL。该方法操作简便,分析时间短,重复性好,准确度高,可用于布地奈德对映体的拆分及其制剂的质量控制。

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