茶叶是世界三大饮料之一, 广受大众欢迎, 其安全性越来越受到关注。为了防治病虫害, 茶叶种植过程中广泛使用农药, 农药残留分析是茶叶质量安全的一个重要指标。我国国家标准GB 2763-2016规定了茶叶中48种农药的最大残留量(MRL)[1], 国际上对茶叶的农药残留量要求也日趋严格[2]。
目前, 国内外涉及茶叶中农药残留传统的检测方法有气相色谱-质谱法(GC-MS)[3-6]、液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)[7-11]和气相色谱-三重四极杆质谱法(GC-MS/MS)[12-18]。其中GC-MS/MS具有极高的选择性、极强的抗干扰能力、高灵敏度和高通量离子传输效率及准确定量的特点, 已经被广泛应用于茶叶的农药残留测试中。
茶叶中富含多种有机酸、维生素、天然色素、咖啡碱、蛋白质、游离糖以及锌、硒、锰、氟等微量元素, 基质成分复杂[19]。在色谱分离中, 最明显的基质效应是基质组分与分析物的共洗脱, 从而影响分析物检测, 此类效应能通过改善检测器的选择性、色谱分离和/或样品前处理解决[20]。GC-MS/MS还存在一些比较难以解决的基质效应, 主要是Erney等[21]提出的基质诱导响应增强效应, 此效应主要影响两类化合物, 一类是在汽化温度下热不稳定的化合物, 一类是样品进入色谱柱或检测器时易被吸附的化合物。另外还有一种基质诱导响应减弱效应, 此效应由GC系统中低挥发性或非挥发性基质组分的逐渐积聚造成, 这些将导致新活性位点的形成以及分析物响应值的逐渐减小[22-24]。
基质诱导增强效应可以通过去除活性位点或基质组分减弱, 或利用替代的校准方法进行补偿, 方式包括基质匹配标准溶液、添加保护剂、标准加入法以及同位素标记内标[20]。目前大多数方法采用基质样品配制农药标准溶液以校正基质效应引入的定量误差, 但对于不同种类的茶叶, 须采用相同的茶类样品配制农药标准工作溶液, 由于茶叶农药残留检出阳性率较高, 空白茶叶样品少, 较难配制相应的基质匹配标准溶液, 且操作过程繁琐。
本研究针对茶叶这种复杂基质, 建立了一种向样品中加入QuEChERS缓冲盐, 用乙腈提取和固相萃取法(SPE)净化、GC-MS/MS测定53种农药残留量的方法, 通过在仪器端采用超高惰性流路和利用双色谱柱串联设置柱后反吹模式、在标准溶液中添加混合保护剂、并结合双内标进行定量的方式, 有效地降低农药的基质效应, 实现茶叶中多种农药快速有效的检测。
7890B-7000D型气相色谱-串联质谱仪, 配有电子轰击(EI)离子源(美国Agilent公司); AB204-S分析天平(瑞士Mettler Toledo公司); Centrisart® D-16C高速冷冻离心机(德国Sartorius公司); XW-80A涡旋混合器(上海精科公司); SPH-310F摇床(上海世平公司); OSB-2100旋转蒸发仪(日本EYELA公司)。
QuEChERS缓冲盐包(美国Waters公司); ENVI-Carbon/NH2净化小柱(美国Agilent公司); 乙腈、丙酮、甲苯(色谱级, 美国Merck公司); 53种农药标准品和2种内标(纯度≥ 98%, 德国Dr. Ehrenstorfer公司); 古洛糖酸内酯、山梨醇(纯度≥ 98%, 德国Sigma-Aldrich公司)。
分别准确称取适量的农药标准品, 用丙酮溶解并定容, 配制成1 000 mg/L的53种单一农药标准储备液和两种内标储备液(蒽醌-D8和磷酸三苯酯); 移取适量农药标准储备溶液至容量瓶中, 用丙酮稀释并定容, 配制成10 mg/L的农药混合标准储备液; 移取适量内标储备溶液至容量瓶中, 用丙酮稀释并定容, 配制成10 mg/L的内标混合储备液; 称取适量古洛糖酸内酯和山梨醇, 用乙腈溶解并定容, 配制成10 g/L的保护剂混合储备液; 再移取上述的农药混合标准储备液、内标混合储备液和保护剂混合储备液至容量瓶中, 用丙酮稀释并定容, 配制成浓度分别为20、50、100、200、300、500 μg/L的标准工作溶液, 其中内标浓度为200 μg/L, 保护剂浓度为200 mg/L。农药标准溶液均贮存于(-18±4) ℃冰箱中。
茶叶样品粉碎, 混匀, 取2.5 g样品于50 mL离心管中, 加入25 μL内标溶液(10 mg/L), 再加入10 mL水, 涡旋使样品分散到水溶液中, 浸泡30 min。加入25 mL乙腈, 放到摇床上振荡5 min后加入QuEChERS缓冲盐包, 混匀后置于冷冻离心机中, 在4 ℃、8 000 r/min条件下离心5 min。
用移液枪取20 mL上清液于另一50 mL离心管中, 加入6.67 mL甲苯, 涡旋混匀后上净化小柱。净化小柱先用10 mL乙腈-甲苯溶液(3：1, v/v)活化, 上样后让其自然吸附, 再用5 mL乙腈-甲苯溶液(3：1, v/v)进行洗脱。洗脱液用旋转蒸发仪浓缩至剩余少许有机溶剂后, 用氮吹仪吹干, 用1 mL丙酮定容。
色谱条件 两根HP-5MS UI色谱柱(15 m×0.25 mm×0.25 μm)串联, 载气为高纯氦气(纯度99.999%), 流速为0.9 mL/min(1#柱)和1.1 mL/min(2#柱)。柱温起始温度60 ℃, 保持1 min, 以40 ℃/min速率升温至170 ℃, 再以10 ℃/min速率升温至310 ℃。进样方式为脉冲不分流, 脉冲压力137.9 kPa, 0.75 min后打开分流阀, 进样量2 μL, 进样口温度280 ℃, 传输线温度280 ℃。采用柱后反吹, 在运行结束后, 设置柱温310 ℃, 反吹压力为275.8 kPa, 进样口压力为6.895 kPa, 反吹时间为5 min。在GC-MS/MS上设置的双色谱柱及后运行反吹模式见图 1。
质谱条件 电离方式为电子轰击电离源(EI), 动态多反应离子监测(dMRM)模式监测, 电离能量70 eV。四极杆温度150 ℃, 离子源温度280 ℃, 溶剂延迟3 min。碰撞气为高纯氮气(纯度99.999%)。
本文通过优化柱箱升温程序, 可以在20.75 min内将53种农药有效分离。茶叶基质复杂, 进样方式采用脉冲不分流, 可以降低基质在衬管内的停留时间, 从而降低基质效应带来的影响。通过采用双色谱柱串联, 设置柱后反吹模式, 在分析待测物质后, 利用压力差将停留在色谱柱内部的低挥发性基质组分往进样口方向吹扫, 可以提高色谱柱的寿命, 降低维护成本。
质谱端采用dMRM模式, 优化离子对的碰撞能量, 针对不同农药的出峰时间特点选择合适的峰宽, 在确保每个离子对扫描10个点以上使每个离子对的驻留时间达到最优化, 并根据茶叶的特点, 删去在基质中干扰严重的离子对, 最终得到53种农药及两种内标的保留时间、离子对、碰撞电压等dMRM参数, 详见表 1。根据优化后的GC-MS/MS条件对农药混合标准溶液进行分析, 该条件下53种农药可获得较好的分离, 其峰形和信噪比均较理想。53种农药(20 μg/L)的总离子流色谱图(TIC)见图 2。
基质效应包括基质诱导增强效应和基质诱导减弱效应, 与GC系统中活性位点的数量、分析物的特点、基质类型、相互作用时间、进样口参数等有关[20]。农药化合物通常含有羟基(-OH)和氨基(R-NH-)官能团、咪唑类和苯并咪唑类化合物(-N=)、氨基甲酸酯(-O-CO-NH-)、尿素衍生物(-NH-CO-NH-)和有机磷(-P=O)基团。这类分子易与流路表面的活性位点发生相互作用, 发生化合物吸附或降解。因此, 应尽量保持GC系统的惰性去活。GC系统样品流路中的各个部件若是惰性化程度不够, 将可能导致物质响应低甚至不出峰、峰拖尾、不稳定等情况。GC系统样品流路从进样到检测器, 涉及进样口及其衬管和分流平板、色谱柱、两通分流接口、密封圈。提高整个流路的惰性化程度可以有效地降低基质效应的影响。
在同一条件下, 由53种农药配制成茶叶基质混合标准溶液(10 μg/kg), 分别采用普通衬管和超高惰性衬管连续进样10针, 结果表明超高惰性衬管具有更优的稳定性。对于基质效应明显的农药, 均有类似的现象。因此, 本方法GC-MS/MS采用具有超高惰性的分流/不分流进样口、衬管、分流平板及色谱柱。
有研究表明[22-24], 含多个羟基的糖类和糖类衍生物(如山梨醇)可增强峰信号, 适用于低挥发性农药, 而古洛糖酸内酯可形成宽峰, 覆盖了非常广泛的农药洗脱范围, 适用于半挥发性农药, 同时使用古洛糖酸内酯和山梨醇可实现最大的整体增强效果, 故本研究采用两者的混合溶液作为保护剂。
本文以4种不同的农药(氟乐灵、五氯苯胺、毒死蜱、联苯菊酯)为例, 考察了基质组分和保护剂对农药在GC系统中的影响。由图 3a可以看出, 纯溶剂中(未添加基质组分和保护剂)农药的色谱图峰形较宽。这是由于GC系统中游离硅醇基和非挥发性基质的沉积, 在GC进样口和色谱柱中产生大量活性位点, 而敏感分析物在这些活性位点上易发生吸附或降解。当向农药标准溶液中添加混合保护剂(图 3b)或基质组分(图 3c)后, 保护剂或基质组分会限制活性位点, 从而有效改善了农药在纯溶剂中峰拖尾的情况。由两种情况的谱图可以看出, 保护剂与基质具有相似的效果, 这说明保护剂可以替代基质, 解决农药残留测试中难以配制茶叶基质匹配标准溶液的问题, 提高配制农药标准溶液的效率。
同时, 本文还比较了农药在纯溶剂标准溶液中和在添加了保护剂的标准溶液中两种不同的基质效应, 结果见图 4。基质效应(matrix effect, ME)=B/A×100%, 其中, A为纯溶剂或添加了保护剂的标准溶液中农药的响应值, B为空白样品基质中添加相同含量农药的响应值[17]。基质效应越接近于100%, 说明基质效应越不明显, 标准溶液定量的结果越准确。
从纯溶剂的基质效应数据(图 4阴影柱)可以看出, 在GC-MS/MS上, 茶叶中农药的基质增强效应明显, 近一半的农药落在了基质增强部分(130% ~200%和＞200%)。而添加保护剂后(图 4空白柱), 大部分农药的基质效应明显减弱, 并且基质效应在60% ~130%范围内的农药数量比例增多。这说明在农药标准溶液中添加保护剂可有效提高定量的准确性。
因此, 本文采用添加了保护剂的标准溶液进行定量, 能够很好地解决纯溶剂标准溶液的峰形宽、保留时间漂移及基质效应的问题。同时, 保护剂的使用可以惰性化GC系统, 减少分析物的相互作用, 从而提高其耐用性、稳定性和重现性, 降低GC系统中进样口和色谱柱的维护频率。
一方面, 在优化了仪器端参数条件、选用惰性流路, 并在标准溶液中添加保护剂之后, 茶叶中基质效应＜60%的农药比例仍有35.8%(图 4空白柱), 给定量带来一定的误差; 另一方面, 在茶叶基质干扰下, 农药在前处理过程中易被吸附或降解, 故采用内标法定量可以提高定量结果的准确性。由于TPP的化学基团与大部分农药存在类似的结构特点, 适合作为农药残留测试的内标, 已被用于多个QuEChERS标准方法[25-27], 故本方法首先采用TPP作内标考察定量效果。
但研究中发现, 七氯、八氯二丙醚、杀螟硫磷、毒死蜱、蒽醌、三唑酮、三氯杀螨醇、甲基异柳磷、环氧七氯、喹硫磷等10种农药, 若采用TPP作内标无法达到理想的回收效果。由于这些物质的保留时间均在蒽醌附近, 且蒽醌是一种在茶叶中常检出的物质, 欧盟的MRL低, 只有0.02 mg/kg[2], 故本研究以蒽醌为代表进行考察。根据文献报道, 蒽醌的氘代物(An-D8)可以提高蒽醌定量的准确性[14, 28]。故本研究采用An-D8作为另一种内标, 并针对以上10种农药, 对两种内标的选择进行了比较。
在低(0.01 mg/kg)、中(0.10 mg/kg)、高(0.25 mg/kg)3个加标浓度水平下, 重复测定两次, 分别采用An-D8和TPP作内标进行定量, 分析茶叶中这10种农药的加标回收率, 结果见表 2。通过比较可知, 若采用TPP作内标得到的回收率均偏低, 无法满足测试要求, 而采用An-D8作内标则能将回收率校正至合理范围。因此, 本方法选择An-D8作为这10种农药的内标。
按1.2.1节配制农药标准工作溶液, 在优化后的仪器实验条件下测定各溶液, 绘制标准曲线, 得到线性方程及相关系数(r2)。结果显示本方法中的53种农药在20~500 μg/L内均具有良好的线性(r2≥0.99), 其中氯氰菊酯为两种同分异构体之和, 其线性范围为40~1 000 μg/L。以S/N=3确定检出限(LOD), 以S/N=10确定定量限(LOQ), 得到本方法中28种农药的LOQ小于10 μg/kg, 另外25种农药的LOQ在10~20 μg/kg之间(见表 3)。
选择无农药残留的有机茶作为空白样品基质, 向样品中添加53种农药进行样品加标回收试验。在低(0.01 mg/kg)、中(0.10 mg/kg)、高(0.25 mg/kg)3个加标水平下, 每个水平做6个平行样品, 按照本方法进行测定, 结果见表 4。由表 4可知, 在茶叶基质中, 除了喹硫磷由于灵敏度差, 未能进行低水平回收率测试和精密度测试外, 农药的回收率为72.5% ~130.9%, 相对标准偏差(RSD)为0.4% ~19.4%, 其中93.7%的目标物的RSD小于15%。数据说明本方法精密度高, 重复性好。
利用所建立的方法对乌龙茶、绿茶、红茶、普洱茶、白茶等不同茶叶样品共122份进行了53种农药残留的检测。结果显示, 针对本检测方法中的53种农药, 检出率较高的农药为联苯菊酯、蒽醌、氯氰菊酯和溴虫腈, 检出率分别为60.7%、48.4%、37.7%和29.5%, 图 5是代表性样品(乌龙茶和绿茶)的总离子流色谱图。研究结果表明, 本方法适用于茶叶中53种农药残留的检测。
本文利用固相萃取-气相色谱-三重四极杆质谱联用技术, 建立了茶叶中53种农药残留的双内标分析方法, 测定的农药种类较全, 涵盖了有机磷类、有机氯类、拟除虫菊酯类等农药; 并且通过优化仪器色谱、质谱参数, 采用动态多反应监测模式和加入保护剂等方式减弱了茶叶的基质效应, 降低了背景干扰, 提高了分析灵敏度, 可满足国内外对茶叶中多种农药残留量的日常检测要求。
2018,
Vol. 36 Issue (6): 531-540
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