超高效液相色谱-串联质谱法测定蛋白胨中9种B族维生素


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姜莎¹, 辛慧², 莫日根², 杜艳², 李振莲², 朱叶青²

1. 内蒙古自治区食品检验检测中心, 内蒙古呼和浩特 010090;
2. 呼和浩特市食品检验所, 内蒙古呼和浩特 010090

收稿日期：2019-04-09

基金项目：科技部"食品安全关键技术研发"重点专项（2017YFC1601400）

通讯联系人：朱叶青.Tel:(0471)3457971, E-mail:hhhtzyq@sina.com

摘要：建立了能够同时测定蛋白胨中9种B族维生素的超高效液相色谱-串联质谱法（UPLC-MS/MS）。样品经水溶解后，滤液经Syncronis C₁₈色谱柱分离，采用电喷雾电离源，正离子、多反应监测模式进行检测，分析时间8 min，外标法定量。结果表明，9种B族维生素在各自质量浓度范围内线性良好，相关系数（R²）均大于0.999，方法的检出限为0.09~1.67 μg/L，方法的相对标准偏差均 < 3%（n=6）；9种B族维生素不同添加水平下的平均回收率为80.2%~103.9%。该方法简便、准确，灵敏度高，适用于蛋白胨中B族维生素的测定。

关键词：超高效液相色谱-串联质谱 B族维生素蛋白胨

Determination of nine B vitamins in peptone using ultra high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry

JIANG Sha¹, XIN Hui², MO Rigen², DU Yan², LI Zhenlian², ZHU Yeqing²

1. Food Inspection and Testing Center of Inner Mongolia Autonomous Region, Hohhot 010090, China;
2. Hohhot Food Inspection Institute, Hohhot 010090, China

Foundation item: the Special Program for Key Technology in Food Safety of the Ministry of Science and Technology of China (No. 2017YFC1601400)

Abstract: A method using ultra high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (UPLC-MS/MS) was developed for the determination of nine B vitamins in peptone. The samples were extracted with water. The analytes were separated on a Syncronis C18 column (100 mm×2.1 mm, 1.7 μm). The nine B vitamins were detected by ESI-MS/MS under the multiple reaction monitoring (MRM) mode, and the analysis was completed in 8 min. Quantification analysis was performed by using the external standard method. The correlation coefficients (R²) of the nine B vitamins in their linear ranges were greater than 0.999. The limits of detection were 0.09-1.67 μg/L. The relative standard deviations of the method were less than 3% (n=6). The mean recoveries of the nine B vitamins were 80.2%-103.9% at different spiked levels. The method is simple, accurate and sensitive, and is suitable for the determination of the nine B vitamins in peptone.

Key words: ultra high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (UPLC-MS/MS) B vitamins peptone

维生素是维持人和动物正常生理功能不可或缺的一类微量有机物质, 在人体生长、代谢、发育过程中发挥着重要作用^[1]。人体必需维生素可分为两类:水溶性维生素和脂溶性维生素, 其中水溶性维生素中又以B族维生素最为重要^{[2, 3]}, B族维生素主要包括硫胺素(VB₁)、核黄素(VB₂)、烟酰胺、烟酸(VB₃)、泛酸(VB₅)、吡哆素(VB₆)、生物素(VB₇)、叶酸(VB₉)和钴胺素(VB₁₂)等^{[4, 5]}。蛋白胨是一种利用蛋白质酶解得到的水溶性混合物。作为微生物培养基的基础成分, 蛋白胨可以提供大部分微生物生长、发育、繁衍所需要的营养氮源^{[6, 7]}。近年来, 蛋白胨不仅可以制备成微生物培养基, 还是生产医药、检验商品、检测环境、配置疫苗、检验毒素等所需的生化试剂^{[8, 9]}。然而国内外普遍存在培养基质量差异和批间质量不稳定的问题^{[10, 11]}。培养基原料决定培养基品质^{[12, 13]}, 蛋白胨的产品质量直接影响微生物试验的结果^[14]。目前我国培养基质量标准体系建设较为落后^[15], 培养基原材料的系统研究较少。

建立了超高效液相色谱-串联质谱法(UPLC-MS/MS)同时测定蛋白胨中的9种B族维生素的方法。方法前处理操作简单快速，分析时间短，重复性好，精密度高，可为剖析培养基复杂生物组分构成, 建立由纯化学成分组成的、可溯源的食品微生物参比培养基体系, 以及形成培养基评价规范提供参考。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Ultimate 3000超高效液相色谱仪、TSQ Endura三重四极杆质谱仪(美国Thermo Fisher公司); 旋涡混合器(德国IKA公司); Sartorius万分之一电子天平(北京赛多利斯公司)。

甲醇、甲酸铵均为色谱纯(德国CNW公司); 甲酸为色谱纯(天津市福晨化学试剂厂)。维生素B₂(纯度98.2%)、维生素B₆(纯度100.0%)、维生素B₁₂(纯度90.5%)、烟酸(纯度99.8%)、烟酰胺(纯度99.9%)均购自中国食品药品检定研究院; 维生素B₁(纯度95.2%)、泛酸(纯度96.5%)、叶酸(纯度91.3%)、生物素(纯度99.0%)均购自德国Dr. Ehrenstorfer公司。实验用水由Milli-Q系统(美国Millipore公司)制得。

准确称取适量标准品, 维生素B₁、维生素B₂和生物素用甲酸溶解后用甲醇定容, 其他标准品均用甲醇溶解并定容, 均置于100 mL棕色容量瓶中, 配制标准储备液。移取各标准储备液, 用甲醇稀释成质量浓度为50 mg/L的混合标准中间液, 于-18 ℃避光保存。根据需要用水逐级稀释, 配制成适当质量浓度的混合标准溶液, 现用现配。

1.2 样品前处理

称取0.2 g(精确至0.000 1 g)样品，置于50 mL离心管中, 加入10 mL水, 振荡提取10 min, 经0.22 μm滤膜过滤后, 供超高效液相色谱-串联质谱仪分析。以上操作均避光进行。

1.3 液相色谱与质谱条件

1.3.1 色谱条件

色谱柱:Syncronis C₁₈色谱柱(100 mm×2.1 mm, 1.7 μm, 美国Thermo Fisher公司); 柱温:25 ℃; 样品室温度:10 ℃; 流速:0.30 mL/min; 流动相A: 0.1%(v/v)甲酸水溶液; 流动相B: 0.1%(v/v)甲酸甲醇溶液。梯度洗脱程序:0~2.0 min, 90%A; 2.0~3.0 min, 90%A~45%A; 3.0~3.5 min, 45%A~10%A; 3.5~4.0 min, 10%A~90%A; 4.0~8.0 min, 90%A。进样量:2 μL。

1.3.2 质谱条件

离子源:ESI源; 扫描方式:正离子扫描; 检测方式:多反应监测(MRM)模式; 离子源温度：370 ℃; 离子传输管温度：370 ℃; 离子喷雾电压：4 000 V; 鞘气流速:1.7 L/min; 辅助气流速：0.7 L/min; 碰撞气:氩气。MRM监测离子对、化合物保留时间和碰撞能量(CE)等参数见表 1。

表 1 MRM扫描模式下9种B族维生素的质谱参数 Table 1 MS parameters of the nine B vitamins in MRM scan mode

No.	Compound	Retention time/min	Precursor ion (m/z)	Product ion (m/z)	Collision energy/V
1	vitamin B₁	0.8	265.2	122.1^*	13
				144.0	11
2	vitamin B₂	5.2	377.3	243.0^*	22
				172.1	37
3	vitamin B₆	1.3	170.2	152.1^*	13
				134.0	21
4	vitamin B₁₂	5.0	678.6	147.1^*	38
				359.0	21
5	pantothenic	4.6	220.2	202.0^*	12
	acid			90.1	14
6	folic acid	5.1	442.2	295.1^*	12
				176.1	37
7	nicotinic acid	1.4	124.2	78.2^*	22
				80.2	22
8	nicotinamide	1.4	123.2	80.2^*	20
				78.2	23
9	biotin	5.2	245.2	227.1^*	15
				166.0	22
* Quantitative ion.

表 1 MRM扫描模式下9种B族维生素的质谱参数 Table 1 MS parameters of the nine B vitamins in MRM scan mode

2 结果与讨论

2.1 流动相的选择

质谱应用技术中, 流动相的选择除考虑色谱的分离效果外还要考虑化合物的离子化程度, 由于本实验选用电喷雾电离源、正离子模式, 所以在流动相中添加了甲酸。此外, 有机相分别采用甲醇和乙腈进行优化, 分析各种维生素的响应强度, 最终采用甲醇作为流动相中的有机相。

实验还通过调节流动相比例及流速获得最佳条件, 结果表明, 在流速为0.30 mL/min时, 选用0.1%(v/v)甲酸水溶液和0.1%(v/v)甲酸甲醇溶液作为流动相, 各组分分离效果良好, 峰形对称, 响应值最高, 无杂质峰干扰。

2.2 质谱条件的优化

为了确定本实验的MRM条件, 依次将单一标准品溶液(1.0 mg/L)不经过色谱柱直接泵入质谱中, 在ESI^-模式下, 大部分维生素响应较低; 在ESI⁺模式下, 9种B族维生素均能获得丰度较高的母离子, 其中盐酸盐、钙盐等都会脱去盐后以单一分子的状态离子化, 得到[M+H]⁺峰, 维生素B₁₂则为多电子物质, 满足[M+H]⁺/n规律。确定母离子后, 分别对其子离子进行二级质谱扫描, 选择丰度较高、干扰较小的两对子离子作为定性离子, 丰度最高的离子作为定量离子, 然后优化其碰撞能量。优化后9种B族维生素的MRM参数见表 1, 色谱图见图 1。

图 1 9种B族维生素混合标准溶液的色谱图(500 μg/L) Fig. 1 Chromatograms of the nine B vitamins mixed standard solution (500 μg/L)

2.3 方法学评价

2.3.1 线性范围和检出限

用0.1%(v/v)甲酸水溶液配制标准溶液, 以各B族维生素的峰面积为纵坐标(y)、质量浓度为横坐标(x, μg/L)绘制标准曲线。结果表明, 9种维生素均具有良好的线性关系, 相关系数(R²)均大于0.999。以信噪比为3和10时的进样浓度为最低检出含量和最低定量含量, 根据样品前处理过程, 最终计算得出该方法的检出限为0.09~1.67 μg/L, 定量限为0.3~5.6 μg/L(见表 2)。

表 2 9种B族维生素的线性范围、相关系数、检出限及定量限 Table 2 Linear ranges, correlation coefficients (R²), limits of detection (LODs) and limits of quantification (LOQs) of the nine B vitamins

2.3.2 方法的精密度

对同一空白样品, 加入0.1 mL 30 mg/L的维生素B₁标准溶液, 50 mg/L的维生素B₂、B₆、B₁₂、泛酸、叶酸、烟酰胺标准溶液, 60 mg/L的烟酸标准溶液, 40 mg/L的生物素标准溶液, 取样6次, 按本研究所述方法进行测定, 计算相对标准偏差。结果表明, 各B族维生素含量的RSD均小于3.0%, 表明该方法的精密度良好。

2.3.3 方法的回收率

在空白蛋白胨样品中分别添加低、中、高3个水平的混合标准溶液, 每个水平取样3次, 分别测定, 以评价不同添加水平的可靠性。由表 3可知, 样品的加标回收率为80.2%~103.9%, 相对标准偏差均＜3.0%。

表 3 9种B族维生素的加标回收率(n=3) Table 3 Spiked recoveries of the nine B vitamins (n=3)

No.	Compound	Spiked/ (μg/L)	Mean value/ (μg/L)	Recovery/ %	RSD/ %
1	vitamin B₁	210	179.8	85.6	1.6
		300	253.1	84.4	2.0
		390	323.5	83.0	0.6
2	vitamin B₂	420	352.0	83.8	0.6
		600	534.2	89.0	0.6
		780	691.9	88.7	1.0
3	vitamin B₆	420	341.0	81.2	0.2
		600	545.9	91.0	0.6
		780	687.9	88.2	0.6
4	vitamin B₁₂	420	348.2	82.9	0.1
		600	493.7	82.3	1.4
		780	628.2	80.5	0.8
5	pantothenic acid	420	358.7	85.4	0.4
		600	519.1	86.5	1.3
		780	650.1	83.3	0.2
6	folic acid	420	343.6	81.8	0.6
		600	482.6	80.4	0.3
		780	633.9	81.3	0.1
7	nicotinic acid	420	433.2	103.2	2.5
		600	623.4	103.9	0.4
		780	790.7	101.4	0.5
8	nicotinamide	420	376.5	89.7	0.5
		600	564.8	94.1	1.0
		780	724.4	92.9	0.1
9	biotin	350	288.7	82.5	2.9
		450	368.4	81.9	0.4
		550	441.0	80.2	2.6

表 3 9种B族维生素的加标回收率(n=3) Table 3 Spiked recoveries of the nine B vitamins (n=3)

2.4 实际样品的测定

取3个不同品牌的蛋白胨样品, 按照1.2节和1.3节描述方法处理样品并测定, 计算待测样品中B族维生素的含量, 测定结果见表 4。

表 4 蛋白胨中9种B族维生素的含量 Table 4 Contents of the nine B vitamins in peptone

3 结论

本实验建立了同时测定蛋白胨中9种B族维生素的超高效液相色谱-串联质谱法, 对比B族维生素测定的相关国家标准, 本方法不需要使用繁琐的微生物法或是高效液相色谱-荧光/紫外检测法, 简化了前处理步骤, 降低了检测成本, 提高了检测效率。该法简便、快速、准确、灵敏, 经方法学验证, 所建立方法具有良好的准确度、精密度与重复性, 可为蛋白胨中B族维生素种类和含量的测定提供技术支持, 并为蛋白胨质量提高及标准化生产提供参考。

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