超高效液相色谱-串联质谱法测定人尿及灰尘中N-（1，3-二甲基丁基）-N′-苯基-对苯二胺-醌

doi:10.3724/SP.J.1123.2025.02010

摘要/Abstract

摘要：

为有效监测N-（1，3-二甲基丁基）-N′-苯基-对苯二胺-醌（6PPD-Q）在人群中内外暴露水平，建立了人体尿液及灰尘中6PPD-Q的超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS）分析方法。通过系统优化前处理过程及色谱、质谱分析条件，确定了尿液及灰尘样品中6PPD-Q的最佳检测条件。具体方法如下：尿液样本中加入0.1 ng内标¹³C₆-6PPD-Q平衡30 min后，加入谷胱甘肽和NaCl，经乙酸乙酯超声萃取两次；灰尘样本中加入1.0 ng内标¹³C₆-6PPD-Q，经正己烷超声萃取两次。所得萃取溶剂合并，浓缩至近干，复溶后用于进样分析。采用含0.01%甲酸的10 mmol/L乙酸铵溶液和乙腈作为流动相进行梯度洗脱，Phenomenex Kinetex F5（100 mm×3 mm， 2.6 μm）作为色谱分析柱，在正离子电喷雾（ESI⁺）多反应监测（MRM）模式下检测，内标法定量。在优化的实验条件下，6PPD-Q在0.01~4.00 μg/L（尿液）和0.01~20.0 μg/L（灰尘）范围内具有良好的线性，相关系数分别为0.999 9和0.999 3，检出限分别为0.6 ng/L（尿液）和0.018 ng/g（灰尘）。在低、中、高3个加标水平下，6PPD-Q的加标回收率为90.3%~94.1%，日内精密度为0.9%~5.9%，日间精密度为1.1%~6.3%。基质效应评估结果表明，采用同位素标记内标校正法可有效减少尿液及灰尘基质中6PPD-Q定量分析时的基质干扰。将该方法应用于120份人群尿液样本的分析，尿液样本中6PPD-Q的检出率为74.2%，检出范围为<LOD~13 ng/L，平均值为2 ng/L，中位值为1 ng/L。31份室内灰尘样本中6PPD-Q均有检出，检出范围为1.8~24.9 ng/g，平均含量为5.23 ng/g，中位含量为3.05 ng/g。本方法准确、可靠，且灵敏度高，适用于人体尿液及灰尘中6PPD-Q的检测。

关键词: 超高效液相色谱-串联质谱法, N-（1, 3-二甲基丁基）-N′-苯基-对苯二胺-醌, 尿液, 灰尘

Abstract:

An ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry （UPLC-MS/MS） method was established to determine N-（1，3-dimethylbutyl）-N′-phenyl-p-phenylenediamine-quinone （6PPD-Q） in human urine and dust in order to understand the internal and external exposure levels in humans. The sample preparation conditions were systematically investigated and the chromatographic conditions and MS parameters were optimized. Briefly， internal standard ¹³C₆-6PPD-Q （0.1 ng） was added to a urine sample. Glutathione and NaCl were added after equilibration for 30 min. The mixture was then twice ultrasonically extracted with ethyl acetate. Internal standard ¹³C₆-6PPD-Q （1.0 ng） was also added to a dust sample and the mixture was twice ultrasonically extracted with n-hexane. The combined organic phases were concentrated to near-dryness and then redissolved for instrumental determination， which was performed on a Phenomenex Kinetex F5 column （100 mm×3 mm， 2.6 μm）， with the target analyte gradient eluted using 10 mmol/L ammonium acetate aqueous solution containing 0.01% formic acid and acetonitrile. Positive electrospray ionization （ESI⁺） and multiple reaction monitoring （MRM） modes were used for identification purposes， and an isotope-labeled internal standard was added for quantification. Good linearities were achieved under the optimized conditions within the 0.01–4.00 and 0.01–20.0 μg/L ranges for urine and dust， respectively， with correlation coefficients of 0.999 9 and 0.999 3， respectively. Limits of detection （LODs） were 0.6 ng/L （urine） and 0.018 ng/g （dust）. Spiked recoveries of 6PPD-Q were 90.3%–94.1% at low， medium， and high spiked levels， with intra-day and inter-day precisions of 0.9%–5.9% and 1.1%–6.3%， respectively. Matrix-effect investigations revealed that 6PPD-Q exhibited weak matrix effects in urine and dust after correction with the isotopic internal standard. The developed method was used to analyze 120 human urine samples， which led to a 6PPD-Q detection frequency of 74.2%， with mass concentrations ranging from <LOD to 13 ng/L， with average and median mass concentrations of 2 and 1 ng/L， respectively. However， 6PPD-Q was detected with a frequency of 100% in 31 indoor dust samples with contents of 1.8–24.9 ng/g， and average and median contents of 5.23 –3.05 ng/g， respectively. The developed method is accurate， reliable， highly sensitive， and it is suitable for the rapid determination of 6PPD-Q in human urine and dust samples.

Key words: ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry （UPLC-MS/MS）, N-（1, 3-dimethylbutyl）-N′-phenyl-p-phenylenediamine-quinone （6PPD-Q）, urine, dust

中图分类号:

O658

卢祝靓子, 邓芬芳, 白志军, 彭荣飞, 谭磊. 超高效液相色谱-串联质谱法测定人尿及灰尘中N-（1，3-二甲基丁基）-N′-苯基-对苯二胺-醌[J]. 色谱, 2025, 43(9): 1025-1033.

LU Zhuliangzi, DENG Fenfang, BAI Zhijun, PENG Rongfei, TAN Lei. Determination of N-（1，3-dimethylbutyl）-N′-phenyl-p-phenylenediamine-quinone in urine and dust by ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J]. Chinese Journal of Chromatography, 2025, 43(9): 1025-1033.

图/表 9

表 1 梯度洗脱程序

Table 1 Gradient elution procedure

Time/min	Flow rate/（mL/min）	φ（A）/%	φ（B）/%
Initial	0.3	90	10
1.5	0.3	90	10
4.0	0.3	0	100
11.0	0.3	0	100
12.0	0.3	90	10
15.0	0.3	90	10

表 2 6PPD-Q及内标的质谱参数

Table 2 MS parameters of N-（1，3-dimethylbutyl）-N′-phenyl-p-phenylenediamine-quinone （6PPD-Q） and its internal standard

Compound	Retention time/min	Parent ion （m/z）	Daughter ions （m/z）	Cone voltage/V	Collision energies/eV
6PPD-Q	5.13	299.1	241.1^*， 215.1	60	40， 24
¹³C₆-6PPD-Q	5.13	305.2	247.1^*， 221.1	60	40， 24

图1 使用不同色谱柱时6PPD-Q （1.0 μg/L）的色谱图

Fig. 1 Chromatograms of 6PPD-Q （1.0 μg/L） using different columns

图2 6PPD-Q（2.0 μg/L）及内标（0.5 μg/L）的提取离子色谱图

Fig. 2 Extracted ion chromatograms of 6PPD-Q （2.0 μg/L） and its internal standard （0.5 μg/L）

图3 安装隔离柱前连续进样的样品的提取离子色谱图

Fig. 3 Extracted ion chromatograms of samples following continuous injection before isolator column installationa， e. solvent blank； b， f. standard solution； c， g. first solvent blank right after standard solution； d， h. second solvent blank right after standard solution.

图4 安装隔离柱后连续进样的样品的提取离子色谱图

Fig. 4 Extracted ion chromatograms of samples following continuous injection with isolator column installationa， g. solvent blank； b， h. standard solution； c， i. first solvent blank right after standard solution； d， j. second solvent blank right after standard solution； e， k. urine sample； f， l. spiked urine sample.

图5 使用不同萃取溶剂时6PPD-Q的加标回收率（n=3）

Fig. 5 Recoveries of 6PPD-Q using different extraction solvents （n=3）DCM： dichloromethane； HEX： n-hexane； EA： ethyl acetate； ACN： acetonitrile.

表 3 6PPD-Q在低、中、高3个水平下的加标回收率、日内精密度及日间精密度（n=3）

Table 3 Recoveries， intra-day and inter-day RSDs at low， medium and high levels of 6PPD-Q （n=3）

Intra-day

RSD/%

Inter-day

RSD/%

Recovery/%

Intra-day

RSD/%

Inter-day

RSD/%

Recovery/%

Intra-day

RSD/%

Inter-day

RSD/%

表 4 与其他方法的比较

Table 4 Comparison with other representative researches

Matrix	Sample volume/weight	Redissolved volume	Enrichment factor	Injection volume/μL	LOQ	Detected range	Median	Ref.
Human urine （n=22）	0.2 mL	50 μL	4	2	0.008 μg/L	0.286-0.676 μg/L	0.440 μg/L	［9］
Human urine （adults， n=50）	1 mL	2 mL	0.5	5	0.021 μg/L	0.055-2.11 μg/L	0.40 μg/L	［20］
Human urine （n=100）	1 mL	1 mL	1	5	0.05 μg/L	<LOQ-1.061 μg/g	0.116 μg/g	［23］
Human urine （n=120）	1 mL	200 μL	5	3	0.002 μg/L	<LOD-13 ng/L	1 ng/L	this study
Indoor dust （n=97）	100 mg	50 μL	-	-	0.27 ng/g^a	0.33-82 ng/g	9.5 ng/g	［10］
House dust （n=18）	100 mg	-	-	-	0.11 ng/g	<LOQ-0.4 ng/g	<LOQ	［13］
Road dust （n=22）	100 mg	500 μL	-	-	0.18 μg/L^b	116-1238 ng/g	809 ng/g	［14］
Indoor dust （n=31）	50 mg	500 μL	-	3	0.06 ng/g	1.8-24.9 ng/g	3.05 ng/g	this study

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