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    色谱
    Chinese Journal of Chromatography

    2025, Vol. 43, No. 5
    Online: 2025-05-08

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    目录
    第43卷第5期目次
    2025, 43 (5):  0-0. 
    摘要 ( 32 )   PDF(4630KB) ( 43 )  
    引言
    “外泌体分离分析专辑”引言
    胡良海, 乔晓强, 陶纬国
    2025, 43 (5):  397-398.  DOI: 10.3724/SP.J.1123.2025.01023
    摘要 ( 58 )   HTML ( 20 )   PDF(788KB) ( 50 )  
    视角
    单细胞与单颗粒外泌体分离分析进展与展望
    卜爱香, 武光耀, 胡良海
    2025, 43 (5):  399-412.  DOI: 10.3724/SP.J.1123.2024.11001
    摘要 ( 100 )   HTML ( 15 )   PDF(2353KB) ( 39 )  

    外泌体是细胞分泌的一种纳米级囊泡颗粒,由脂质双分子层包裹,它们在细胞通讯中发挥着重要的作用,并参与到多种生理及病理过程中,如免疫调节、血管生成以及肿瘤的发生与转移等。外泌体携带了来自母体细胞的多种生物分子,因此成为疾病标志物发现的一个重要载体。由于来自不同细胞亚群的外泌体具有显著的异质性,利用传统检测方法仅能获取样本中群体细胞的平均信息,而无法建立外泌体生物功能与亚型之间的明确关联。因此,为了深入探究外泌体的特异性并清晰区分不同亚型外泌体的特征,有必要在单细胞及单颗粒水平上对外泌体进行表征。常用的单颗粒外泌体表征技术主要包括流式细胞术、超分辨显微镜、原子力显微镜、表面增强拉曼光谱、邻近编码技术和质谱技术等。本文总结了基于微流控技术的单细胞外泌体分离分析方法及单颗粒外泌体表征技术的最新进展,并对新兴技术(如Olink蛋白质组学、点击化学和分子印迹技术等)在单细胞及单颗粒外泌体研究中的应用前景进行了展望。

    基于亲和作用力的外泌体高效分离方法的经典策略和研究进展
    王海燕, 谢沛涓, 乔晓强, 张丽媛
    2025, 43 (5):  413-423.  DOI: 10.3724/SP.J.1123.2024.11004
    摘要 ( 131 )   HTML ( 14 )   PDF(7267KB) ( 59 )  

    外泌体是大多数细胞分泌的细胞外囊泡的一个特殊亚类,存在于血液、尿液、唾液、羊水、乳汁等各种生物体液中,也存在于各种组织和细胞间隙中,是细胞间通讯的重要介质。越来越多的研究表明,基于外泌体的液体活检有望成为疾病早期诊断、治疗监测以及预后评估的重要手段,高质量外泌体的分离则是保障后续相关诊断及治疗结果准确性和可重复性的前提和保障。然而,由于外泌体在样本中丰度较低,且与体液中的类似成分(如细胞碎片、蛋白质)共存,如何在复杂的生物样本中实现其高效的分离仍具有挑战性。目前,基于外泌体的物理、化学和生物特性,已发展出多种外泌体分离技术。近年来,基于亲和作用力的外泌体高效分离方法克服了传统分离方法的局限性和弊端,在科研和临床中得到了广泛应用。本文聚焦外泌体分离富集领域,系统综述了近年来基于亲和作用力的外泌体分离富集方法,并对外泌体分离富集方法的发展前景进行了分析和展望,期望为外泌体分离方法新策略的构建及应用提供参考。

    外泌体的核酸适配体筛选技术研究进展
    郑李婷, 杨歌, 屈锋
    2025, 43 (5):  424-433.  DOI: 10.3724/SP.J.1123.2024.10029
    摘要 ( 82 )   HTML ( 6 )   PDF(1579KB) ( 22 )  

    外泌体密切参与细胞间通讯,调控细胞生理过程,是目前癌症和其他疾病早期诊断的潜在生物标志物之一。因此,具有特定功能的外泌体的检测与分离具有重要临床意义。与此同时,开发低成本、高灵敏度的外泌体特异性识别元件,将在疾病早期诊断和治疗过程中发挥关键作用。核酸适配体是通过指数富集配体系统进化技术(systematic evolution of ligands by exponential enrichment, SELEX)筛选获得的、可与靶标特异性结合的单链脱氧核糖核酸或核糖核酸,具备稳定性高、可化学合成、高亲和力和特异性以及靶标范围广等独特优势。目前,靶向外泌体的适配体已应用于细胞成像、药物递送、疾病诊疗等众多研究领域。然而,外泌体的异质性以及复杂结构,为精准识别特定外泌体的适配体筛选带来巨大挑战,高效的筛选技术是获得优良性能适配体的关键。本文总结了外泌体适配体筛选过程中关键靶点的功能及其选择策略,概述了目前应用于外泌体适配体筛选的主要方法与应用,包括磁珠-SELEX、微流控-SELEX、硝酸纤维素膜-SELEX、细胞-SELEX和毛细管电泳-SELEX等5种筛选技术,并对其分离原理、优势与限制以及最新应用进行阐述与分析。最后,对外泌体适配体筛选所面临的问题与挑战进行了总结与展望。

    专论与综述
    外泌体分离富集技术及其在疾病诊疗中的应用
    侯国姗, 袁辉明, 梁振, 张丽华, 张玉奎
    2025, 43 (5):  434-445.  DOI: 10.3724/SP.J.1123.2024.09007
    摘要 ( 109 )   HTML ( 11 )   PDF(2076KB) ( 94 )  

    外泌体是由细胞分泌的脂质双分子层包裹的纳米级囊泡颗粒,携带多种蛋白质、脂质、核酸、代谢物等成分,广泛存在于各种体液中,是细胞间通讯的重要介质。外泌体参与免疫调节、血管生成、肿瘤发生和转移等多种生理病理过程,在临床诊疗中具有巨大潜力。首先,外泌体来源丰富、结构稳定、反映亲本细胞状态,有望成为疾病的新型诊断标志物。其次,干细胞来源的外泌体具有治疗潜力,且具有低免疫原性、高安全性和易于存储等优点,对神经退行性疾病、心血管疾病和癌症等疾病具有治疗潜力。另外,外泌体生物相容性好,具有天然的归巢性能,易穿透生物屏障,是优良的药物递送载体。外泌体的分离富集是其下游分析和应用的前提,高纯度、高收率、高通量的分离方法将有助于发挥外泌体在临床诊疗中的应用潜力。基于外泌体的密度、尺寸、电荷、表面成分等物理化学性质,外泌体分离方法主要分为基于密度的分离方法、基于尺寸的分离方法、聚合物沉淀法以及化学亲和法等。本文对目前外泌体分离富集技术的最新进展进行了归纳总结,并对其在疾病诊断标志物筛选、干细胞来源外泌体用做治疗剂以及外泌体用做药物递送载体等应用进行了介绍,最后对面向疾病诊疗的外泌体分离富集技术的未来发展趋势进行了展望。

    多肽识别导向的外泌体分离富集方法研究进展
    徐坤, 黄嫣嫣, 赵睿
    2025, 43 (5):  446-454.  DOI: 10.3724/SP.J.1123.2024.10015
    摘要 ( 87 )   HTML ( 3 )   PDF(1970KB) ( 44 )  

    外泌体是由细胞分泌的双层膜囊泡,携带有丰富的生物分子,是细胞间信息交流的重要媒介,与多种疾病的发生发展密切相关。在复杂体系中开展外泌体分离富集研究,对于疾病诊断、预后检测和分子机制研究具有重要意义。但外泌体广泛存在于复杂生命体系中,尺寸小且分布范围宽,为其分离富集带来了困难与挑战。目前已经发展了基于物理性质的超速离心、体积排阻色谱、超滤和聚合物沉淀等方法。以亲和配体为识别单元,基于分子识别的亲和分离策略能够实现外泌体高选择性分离富集。在众多分子识别工具中,多肽凭借着可设计性强、构象自由灵活等优势,被应用于外泌体亲和分离之中。本文首先对目前外泌体分离富集方法进行了总结,之后重点介绍了以外泌体蛋白质和生物膜特性为靶标的亲和多肽设计与筛选原理及其在外泌体亲和分离富集中的应用。

    基于微流控技术的外泌体分离分析及临床应用
    邢宇航, 任香善, 李东浩, 刘璐
    2025, 43 (5):  455-471.  DOI: 10.3724/SP.J.1123.2024.10032
    摘要 ( 46 )   HTML ( 3 )   PDF(3766KB) ( 20 )  

    外泌体是由细胞分泌的纳米级囊泡,其中富含脂质、蛋白质、核酸等多种生物功能分子。外泌体在生物体内的信息传递、疾病机理研究及诊断等方面扮演着类似“物联网、互联网”的关键角色。然而,受限于外泌体来源、尺寸、内含物以及功能的异质性,外泌体分离分析仍然面临诸多挑战。传统外泌体分离分析方法包括超速离心、尺寸排阻和免疫共沉淀等,但这些方法普遍存在产量低、纯度低等问题限制了其进一步的临床应用。微流控技术因其微型化、高通量、自动化和集成化等特点为复杂生物样本的高效分离分析提供了强有力的工具。基于此,本文系统总结了基于微流控技术的外泌体分离和分析方法。首先,讨论了基于外泌体的尺寸、电荷、表面官能团等物化性质结合微流控技术分离外泌体及外泌体亚群的分离方法;其次,分析了基于微流控平台的外泌体检测手段,包括外泌体群体分析方法和单个外泌体分析方法;最后,探讨了微流控技术在外泌体临床应用中的前景,并在疾病诊断和治疗方面进行了展望。微流控技术有望突破传统研究中的分离分析瓶颈,为癌症等重大疾病的精准诊断及治疗提供新技术、新平台。

    脂质体与外泌体在药物递送和生物标志物筛选中的研究进展
    苏雅婷, 钱小红, 秦伟捷
    2025, 43 (5):  472-486.  DOI: 10.3724/SP.J.1123.2024.08012
    摘要 ( 96 )   HTML ( 3 )   PDF(1683KB) ( 33 )  

    囊泡分为人工囊泡和天然囊泡。其中,人工囊泡的一种代表性形式是脂质体,它们是由人工合成的,由一个或多个磷脂双分子层构成的球形脂质结构。脂质体的生物相容性和生物利用度较高,稳定性好且易于合成,是靶向药物递送系统(DDS)中常用的纳米载体之一,使用频率较高。作为一种天然囊泡,细胞外囊泡(EVs)是由细胞主动分泌的一种具有膜结构的微小囊泡,内含核酸、蛋白质及脂类等多种成分,是细胞间通信的重要媒介。外泌体是EVs中的最小亚型,直径为30~100 nm,内含独特的生物分子,这些分子可被视为亲代细胞的“指纹”。在病理状态下,外泌体的含量会发生变化,因此被视为诊断疾病的潜在生物标志物。近年来,脂质体与外泌体在药物递送和生物标志物筛选领域日益受到关注。本文介绍了脂质体的制备技术及外泌体的富集分离技术,并深入探讨了它们在药物递送及生物标志物筛选方面的研究进展。最后,文章提出了脂质体与外泌体在临床应用中所面临的挑战。

    外泌体在神经退行性疾病中的作用研究进展
    卜彩婷, 竺雪冬, 张倩颖, 邵文亚
    2025, 43 (5):  487-497.  DOI: 10.3724/SP.J.1123.2024.10035
    摘要 ( 73 )   HTML ( 3 )   PDF(1564KB) ( 17 )  

    外泌体是一种由细胞分泌的纳米级脂质双层囊泡,携带蛋白质、核酸、脂类等重要生物活性分子,广泛存在于血液、脑脊液等体液中。它们通过内吞作用、配体-受体相互作用或直接膜融合等多种机制,将生物活性分子传递给靶细胞,在细胞间通讯中发挥着至关重要的作用。作为天然的药物传递系统,外泌体具有生物相容性、高透过性、靶向性和含天然治疗分子等优势,能够提高药物递送的精确性和疗效,从而成为向中枢神经系统递送药物的理想载体。因此,外泌体在中枢神经系统疾病的诊断与治疗中显示出巨大的潜力。本文系统综述了近年来外泌体在神经退行性疾病中的研究进展,重点探讨了其在疾病发病机制、病程进展、诊断和治疗中的作用,旨在为神经退行性疾病的早期诊断与治疗提供理论依据与研究参考。

    外泌体在生物标志物研究领域的文献计量学分析
    黄雨霞, 王海燕, 张屹涵, 蔺奕菲, 乔晓强, 胡良海
    2025, 43 (5):  498-507.  DOI: 10.3724/SP.J.1123.2025.01025
    摘要 ( 69 )   HTML ( 2 )   PDF(2871KB) ( 14 )  

    外泌体是细胞分泌的细胞外囊泡的一种亚型,携带丰富的遗传物质及蛋白质等,外泌体膜表面有众多母细胞特有的标志物,已成为疾病诊断、疾病进展以及疾病治疗的重要依据。本文在Web of Science core collection(SCI-EXPENED)数据库中,检索2010-2024年间研究主题为“外泌体”与“生物标志物”或“诊断”或“液体活检”的研究型和综述类论文。文献计量分析结果显示,外泌体作为生物标志物标记疾病的研究关注度逐渐升高,中国是该研究的主要贡献国家;文献主要围绕癌症、炎症、糖尿病、神经退行性疾病和心血管疾病的标记诊断展开研究;通常使用色谱、质谱、拉曼光谱等技术分析外泌体核酸、蛋白质、代谢物等;常用的检验样本为血浆、血清、尿液、唾液、脑脊液等体液;外泌体作为肿瘤标志物的研究主要聚焦于肺癌、乳腺癌、前列腺癌等8种具有高发病率的癌症。本文聚焦于外泌体作为疾病生物标志物的研究领域,利用文献计量工具系统分析了2010-2024年间外泌体及其内容物作为生物标志物在疾病诊断领域中的应用,并对外泌体介导的疾病诊断和疾病治疗的发展前景和未来努力方向进行了分析和展望,期望为外泌体在疾病标志及应用方面的研究提供参考。

    研究论文
    尿液细胞外囊泡的高效亲和纯化捕获与蛋白质组学分析
    张贵元, 詹震, 陶纬国, 张昊
    2025, 43 (5):  508-517.  DOI: 10.3724/SP.J.1123.2024.11013
    摘要 ( 140 )   HTML ( 9 )   PDF(3915KB) ( 49 )  
    目前,液体活检因其创伤小、易获取且操作简便的优点,已成为癌症诊断中传统组织活检的替代方法。尿液来源的细胞外囊泡(extracellular vesicles, EVs)已被确定为癌症生物标志物的重要来源。EVs是由细胞分泌的磷脂双分子层囊泡,内含蛋白质、DNA及RNA等成分,且由于双层磷脂膜的保护,EVs内的蛋白质可免受体液中酶的降解。然而,在蛋白质组学分析中,低产率使得从生物体液中分离EVs仍是一个挑战。在本研究中,我们采用亲和磁珠EVlent对尿液中的EVs进行富集,EVlent通过识别EVs表面的特异性蛋白质实现高选择性富集。首先使用蛋白免疫印迹、纳米粒子追踪分析和透射电子显微镜对尿液中的EVs进行综合表征,结果表明,EVlent亲和磁珠成功的从尿液中分离出了EVs,且富集效果优于传统的超速离心方法。接下来,将此方法应用于15例健康志愿者和15例前列腺癌患者的尿液EVs蛋白质组学分析,并筛选潜在的肿瘤标志物。结果显示,健康对照组平均鉴定出2039种蛋白质和14490条肽段,前列腺癌患者中分别鉴定出1982种蛋白质和13100条肽段。进一步分析发现,91种蛋白质属于Vesiclepedia数据库中最常见的100种EV蛋白质。与健康对照组相比,前列腺癌患者尿液EVs中88种蛋白质表达上调,90种蛋白质下调。KEGG分析揭示4种蛋白质(尿激酶型纤溶酶原激活剂(PLAU)、血小板衍生生长因子A(PDGFA)、基质金属蛋白酶3 (MMP3)和神经母细胞瘤RAS病毒癌基因同源物(NRAS))在前列腺癌通路中富集,这些蛋白质未来有希望作为前列腺癌的潜在生物标志物,可以为前列腺癌的早期诊断及预后提供重要依据。
    脑脊液外泌体亚群的分离及其蛋白质组学分析
    陈晓菲, 刘威, 张文镓, 李言鹏, 王志华, 高明霞, 张祥民
    2025, 43 (5):  518-528.  DOI: 10.3724/SP.J.1123.2024.10014
    摘要 ( 123 )   HTML ( 10 )   PDF(3792KB) ( 44 )  

    外泌体是一类尺寸为30~200 nm、携带有蛋白质等生物活性物质的细胞外小囊泡,能够分为具有不同功能的亚群,对外泌体异质性的了解有助于研究其在生理和病理中的作用机制。脑脊液来源的外泌体作为疾病的生物标志物具有巨大潜力,但是相关蛋白质组学的研究报道较少,且缺乏对脑脊液外泌体亚群的研究。本研究发展了串联体积排阻色谱法用于分离脑脊液外泌体亚群,并结合纳升级液相色谱-捕集离子淌度飞行时间质谱联用技术(nanoLC-TIMS-TOF-MS),对创伤性脑损伤患者的外泌体亚群进行了蛋白质组学分析。结果表明,利用串联体积排阻色谱法分离得到4个不同尺寸的脑脊液外泌体亚群,不同亚群共鉴定到739个蛋白质,进一步的蛋白质组学分析结果表明外泌体亚群与细胞信号转导、凝血过程和免疫反应等生物过程密切相关。此外,研究结果揭示了脑脊液外泌体亚群的蛋白表达存在异质性,特别是大尺寸的亚群在不同样本间存在较大的差异。综上,本研究利用开发的串联体积排阻色谱方法分离得到脑脊液外泌体亚群,并从蛋白质组学的角度丰富了对创伤性脑损伤患者脑脊液外泌体的认知。

    细菌外膜囊泡亚群的分离与蛋白质组学分析
    尤柏儒, 邹迅, 吴言, 李荪涛, 肖华
    2025, 43 (5):  529-538.  DOI: 10.3724/SP.J.1123.2024.10028
    摘要 ( 204 )   HTML ( 10 )   PDF(3867KB) ( 110 )  

    外膜囊泡(OMVs)是革兰氏阴性细菌分泌的20~400 nm的具膜囊泡状小体,在毒性物质传递和免疫逃逸等过程中发挥重要功能。尽管许多研究已经揭示了OMVs的关键作用,但是OMVs自身存在的异质性限制了我们对其蛋白质组成和功能的深入研究。因此,对OMVs异质性亚群的组成及其生物学功能开展研究具有重要意义。本研究采用超速离心结合密度梯度离心,对大肠杆菌DH5α和铜绿假单胞菌PAO1分泌的OMVs进行了系统的分离和表征,并结合定量蛋白质组学技术对其进行了全面分析。首先,我们对超速离心得到的两种菌株OMVs粗提物进行了碘克沙醇密度梯度离心,得到了F1~F6 6个组分。接着,通过纳米颗粒追踪分析,确认了DH5α-OMVs和PAO1-OMVs粒径分布,DH5α-OMVs各亚群的平均粒径为131.0~161.0 nm, PAO1-OMVs各亚群的平均粒径为140.0~169.0 nm;通过透射电子显微镜观察到囊泡呈经典的茶托结构;蛋白质的银染和免疫印迹结果共同验证了密度梯度组分中OMVs亚群的分布,同时确定了DH5α-OMVs和PAO1-OMVs亚群的有效组分分别为F1a~F4a和F1b~F5b。然后,我们从DH5α-OMVs和PAO1-OMVs的各亚群中分别鉴定到2388种和905种蛋白质。通过k-means聚类和基因本体(GO)富集分析,我们揭示了不同密度亚群在能量代谢、物质运输、核糖体合成等生物学功能上的异质性。最后,通过对大肠杆菌DH5α-OMVs和铜绿假单胞菌PAO1-OMVs亚群的比较分析,我们发现两种菌株虽然在OMVs的基本功能上具有共性,但在各自的亚群中也展现出了不同的功能特征。DH5α-OMVs的F1a亚群富集了与氨基酸代谢和蛋白质合成相关的功能,而PAO1的F2b亚群则表现出显著的生物大分子合成功能。本研究揭示了细菌OMVs亚群具有不同的生物学功能,进而为理解细菌的致病机制和与宿主的相互作用提供新的理论基础,有利于拓展其生物学应用。

    磷脂酰丝氨酸分子印迹聚合物对血浆外泌体的富集与蛋白质组学分析
    程显惠, 于文静, 王冬雪, 姜丽艳, 胡良海
    2025, 43 (5):  539-546.  DOI: 10.3724/SP.J.1123.2024.05003
    摘要 ( 127 )   HTML ( 18 )   PDF(2984KB) ( 46 )  

    外泌体是肿瘤标志物的重要来源,血浆作为最常用的临床体液之一,其组成较为复杂且存在大量高丰度蛋白质的干扰,如何有效地从血浆中分离外泌体是临床研究的重要挑战之一。本研究将磷脂酰丝氨酸分子印迹聚合物(PS-MIP)用于血浆外泌体的富集,PS-MIP能够特异性识别外泌体质膜上的磷脂酰丝氨酸,从而实现外泌体的高选择性富集。该方法被用于3例健康志愿者和3例胰腺癌患者的血浆蛋白质组学分析和潜在肿瘤标志物的筛选,在健康对照组中的血浆外泌体中鉴定到了1052种蛋白质和4545条肽段,胰腺癌患者血浆外泌体中鉴定到了972种蛋白质和4096条肽段。将蛋白质组学鉴定到的外泌体蛋白质与包含所有细胞外囊泡分子信息的Vesiclepedia数据库进行比较,结果表明84%的PS-MIP富集的血浆外泌体蛋白质存在于该数据库;与只包含外泌体分子信息的ExoCarta数据库进行比较,发现PS-MIP法鉴定出了ExoCarta数据库中Top 100外泌体蛋白质中的77种。与健康对照组相比,胰腺癌患者血浆外泌体中表达量上调的蛋白质有11个,下调的蛋白质有24个。蛋白相互作用网络(PPI)分析显示,相关性较高的前3个蛋白质是补体因子D(CFD)、补体C3(C3)和血管性血友病因子(VWF),在胰腺癌患者外泌体的蛋白质组学表达上调的蛋白质中,外泌体蛋白样糖基转移酶2(EXTL2)、α-2-巨球蛋白样1(A2ML1)和人帕金森病蛋白7(PARK7)的差异最为显著,这些蛋白质可能是胰腺癌诊断和预后评估的潜在生物标志物,为胰腺癌的早期诊断和预后提供了重要的科学依据。

    甘氨酸诱导细菌外膜囊泡分泌的脂质组学分析
    宋静远, 齐秀蕾, 郭怀忠, 胡良海
    2025, 43 (5):  547-555.  DOI: 10.3724/SP.J.1123.2024.10017
    摘要 ( 90 )   HTML ( 12 )   PDF(4499KB) ( 29 )  

    细菌外膜囊泡(outer membrane vesicle, OMV)是由细菌分泌的具有双层磷脂膜结构的外囊泡,携带多种亲本细菌生物活性物质,可作为疾病标志物,因其具有良好的生物相容性,在作为抗癌抗菌药物载体方面也具有很大的潜力。在大肠杆菌培养过程中添加甘氨酸可促进细菌OMV的分泌,但诱导所引起细菌OMV的脂质成分差异未见报道。本研究对甘氨酸诱导前后的细菌OMV的关键质膜组成部分进行脂质组学分析,利用两亲性树枝状聚合物超分子探针对细菌培养上清液进行细菌OMV的捕获,在细菌OMV数量保持一致的条件下,采用甲基叔丁基醚脂质提取法对甘氨酸诱导前后的细菌OMV进行脂质提取。采用超高效液相色谱-离子淌度-飞行时间高分辨质谱仪(UPLC-IMS-QTOF-MS)和MS-DIAL(Mass Spectrometry Data Independent Analysis for Lipidomics)脂质数据分析软件对甘氨酸诱导前后的细菌OMV脂质组成进行分析,确定甘氨酸诱导后细菌OMV关键质膜上的差异脂质种类。研究发现,在大肠杆菌培养过程中添加甘氨酸会引起其大肠杆菌OMV表面和内部脂质成分发生显著变化,神经酰胺(Cer)和溶血磷脂酰胆碱(LPC)的表达呈现出显著升高,双(单酰基甘油)磷酸酯(BMP)的表达显著降低,而甘油三酯(TG)和鞘磷脂(SM)的表达呈现无规律的变化,值得下一步深入探索其调控机制。本研究可为后续的OMV脂质成分深入研究和用于新型药物递送载体的研究提供一定参考。