Deep eutectic solvents modified reversed-phase liquid chromatography for the separation of natural products

doi:10.3724/SP.J.1123.2026.04013

Abstract

Abstract:

The composition of natural products is usually very complex. During the separation of natural products， high loading capacity and satisfactory chromatographic resolution are often hardly achieved. To address this limitation， various modifiers were added in the mobile phase to alter the chromatographic behavior. Here， deep eutectic solvents （DESs） were chosen to accomplish this objective on C18 column. Changes in retention factor， overloaded peak shape and adsorption capacity were systematically investigated and interpreted. The application potential of DESs in the separation of natural products was then evaluated. For ionizable compounds， the addition of DESs could compress the peak width and enhance the resolution. This is closely related to the electrostatic interactions provided by hydrogen bond acceptor （HBA） of DESs. For ionizable basic compounds like nortriptyline hydrochloride， they could remain in a cationic state constantly. Consequently， ion-exchange interactions occurred between nortriptyline cation and residual silanol anion， which resulted in severe peak tailing. However， this interaction could be shielded by the addition of HBA of DESs （such as choline chloride （ChCl））. As the pH of the mobile phase increased， the dissociation of silanol groups was enhanced. This rendered the shielding effect more prominent and led to a higher peak compression of nortriptyline hydrochloride. Notably， although the mobile phase was acidic， the dissociation of silanol groups cannot be completely suppressed. It means that this modulating effect of HBA never disappears. Based on these principles， the semi-preparative separation of berberine from Coptis chinensis extracts was successfully improved. The improvement in the separation of acidic compounds by DESs depends on the ion-pair formation. This effect is highly correlated with the mobile phase pH and salt concentration. Here， benzoic acid was chosen as a model to investigate the overload behavior and adsorption. The results indicated that under neutral conditions， ChCl addition converted the sigmoidal adsorption to a linear type. It can be attributed to the ion-pair formation between benzoate anions and HBA cations. Mutual repulsion between benzoate anions was therefore reduced and adsorption capacity correspondingly enhanced. Furthermore， the results of the overload experiment indicated that ChCl can effectively weaken the solute-solute interactions. It is worth noting that the mobile phase pH is barely influenced after the addition of ChCl. Remarkably， these features are of critical importance for the optimization of preparative chromatographic methods. The beneficial effect of HBAs was validated in the semi-preparative separation of chlorogenic acid from Lonicera japonica extracts. For neutral compounds like morroniside， the HBA in DESs cannot affect their chromatographic behavior through electrostatic interactions. However， there are usually many ionizable impurities surrounding the neutral compounds in natural products. Their chromatographic behavior can be modulated by the HBAs in DESs. The separation of neutral compounds in natural products could be indirectly optimized by modulating their chromatographic behavior. This view was also confirmed by the separation of morroniside from Cornus officinalis extracts.

Key words: deep eutectic solvent （DES）, preparative reversed-phase liquid chromatography, ion-pair chromatography, natural products

CLC Number:

O658

ZHANG Hui, WU Huimin, HE Qun, QIN Tianxue, GUO Suying, LI Wenjing, JIANG Rong, SUN Guangying. Deep eutectic solvents modified reversed-phase liquid chromatography for the separation of natural products[J]. Chinese Journal of Chromatography, 2026, 44(8): 946-959.

Figures/Tables 13

References

[1]	Wu J L， Yu L Q， Wang B J， et al. Chinese Journal of Chromatography， 2025， 43（12）： 1314
[1]	吴嘉蕾，俞力琴，王帮进，等. 色谱， 2025， 43（12）： 1314
[2]	Wang X Q， Cui J， Gu Y M， et al. Chinese Journal of Chromatography， 2023， 41（7）： 562
[2]	王晓庆，崔健，顾一鸣，等. 色谱， 2023， 41（7）： 562
[3]	Cecchi T， Passamonti P. J Chromatogr A， 2009， 1216（10）： 1789
[4]	Shulyak N， Piponski M， Kovalenko S， et al. J Sep Sci， 2021， 44（15）： 2908
[5]	Luca G L， Breitbach Z S， Walsh P L， et al. J Chromatogr A， 2023， 1709： 464392
[6]	El-Deen A K， Abdallah N， Elmansi H， et al. Talanta， 2023， 265： 124813
[7]	Wasylka J P， Rutkowska M， Guardia M D L. J Chromatogr A， 2021， 1639： 461918
[8]	Li G Z， Zhu T， Lei Y J. Korean J Chem Eng， 2015， 32（10）： 2103
[9]	Tan T， Zhang M L， Wan Y Q， et al. Talanta， 2016， 149： 85
[10]	Tan T， Qiao X， Wan Y Q， et al. Chinese Journal of Chromatography， 2015， 33（9）： 934
[10]	谭婷，乔鑫，万益群，等. 色谱， 2015， 33（9）： 934
[11]	Marchel M， Przyjazny A， Boczkaj G. Talanta， 2025， 292： 127963
[12]	Roy D， Miller L. Anal Chim Acta， 2022， 1200： 339584
[13]	Ding S H， Xu Y， Xue S， et al. Talanta， 2024， 275： 126126
[14]	Zhang Y， Fu W， Han J， et al. ACS Sustain Chem Eng， 2022， 10（43）： 14195
[15]	Marchetti N， Cavazzini A， Pasti L， et al. J Sep Sci， 2009， 32（5/6）： 727
[16]	Reta M， Carr P W. J Chromatogr A， 1999， 855（1）： 121
[17]	Dai J， Carr P W. J Chromatogr A， 2005， 1072（2）： 169
[18]	McCalley D V. Chem Commun， 2023， 59（51）： 7887
[19]	Gritti F， Guiochon G. J Sep Sci， 2008， 31（21）： 3657
[20]	Gritti F， Guiochon G. J Chromatogr A， 2004， 1038： 53

DES	Hydrogen bond acceptor （HBA）	Hydrogen bond donor （HBD）	Molar ratio of HBA to HBD	Preparation amounts/g
DES-A	choline chloride （ChCl）	urea	1∶2	11.17+9.60
DES-B	tetramethylammonium chloride	ethylene glycol	1∶3	8.77+14.90
DES-C	ChCl	citric acid	1∶1	11.17+15.37
DES-D	ChCl	glycerol	1∶2	11.17+14.73
DES-E	tetraethylammonium chloride	ethylene glycol	1∶3	13.26+14.90

DES	Hydrogen bond acceptor （HBA）	Hydrogen bond donor （HBD）	Molar ratio of HBA to HBD	Preparation amounts/g
DES-A	choline chloride （ChCl）	urea	1∶2	11.17+9.60
DES-B	tetramethylammonium chloride	ethylene glycol	1∶3	8.77+14.90
DES-C	ChCl	citric acid	1∶1	11.17+15.37
DES-D	ChCl	glycerol	1∶2	11.17+14.73
DES-E	tetraethylammonium chloride	ethylene glycol	1∶3	13.26+14.90

No.	Compound	Contents/（mg/mL）	Injection volumes/μL	Solvent for working solution	Mobile phase composition	Detection wavelength/nm
Determination of the effect of DESs on the retention factors of nortriptyline HCl and benzoic acid on the analytical column
1	nortriptyline HCl	0.1	5	H₂O	ACN-13.8 mmol/L phosphate buffer （PB， pH 2.5， C_DES-A=20.78 mg/mL）（40∶60. All such ratios are volume ratios， and the same applies hereafter.）	230
2	nortriptyline HCl	0.1	5	H₂O	ACN-13.8 mmol/L PB （pH 2.5， C_DES-B=23.66 mg/mL）（40∶60）	230
3	nortriptyline HCl	0.1	5	H₂O	ACN-13.8 mmol/L PB （pH 2.5， C_DES-C=26.54 mg/mL）（40∶60）	230
4	nortriptyline HCl	0.1	5	H₂O	ACN-13.8 mmol/L PB （pH 2.5， C_DES-D=25.90 mg/mL）（40∶60）	230
5	nortriptyline HCl	0.1	5	H₂O	ACN-13.8 mmol/L PB （pH 2.5， C_DES-E=28.15 mg/mL）（40∶60）	230
6	nortriptyline HCl	0.1	5	H₂O	ACN-13.8 mmol/L PB （pH 2.5， C_ChCl=11.17 mg/mL）（40∶60）	230
7	benzoic acid	0.042	50	methanol-H₂O （50∶50）	ACN-9.2 mmol/L PB （pH 6.5， C_DES-A=20.78 mg/mL）（5∶95）	230
8	benzoic acid	0.042	50	methanol-H₂O （50∶50）	ACN-9.2 mmol/L PB （pH 6.5， C_DES-B=23.66 mg/mL）（5∶95）	230
9	benzoic acid	0.042	50	methanol-H₂O （50∶50）	ACN-9.2 mmol/L PB （pH 6.5， C_DES-C=26.54 mg/mL）（5∶95）	230
10	benzoic acid	0.042	50	methanol-H₂O （50∶50）	ACN-9.2 mmol/L PB （pH 6.5， C_DES-D=25.90 mg/mL）（5∶95）	230
11	benzoic acid	0.042	50	methanol-H₂O （50∶50）	ACN-9.2 mmol/L PB （pH 6.5， C_DES-E=28.15 mg/mL）（5∶95）	230
12	benzoic acid	0.042	50	methanol-H₂O （50∶50）	ACN-9.2 mmol/L PB （pH 6.5， C_ChCl=11.17 mg/mL）（5∶95）	230
Investigation of the effect of ChCl on the retention factor of nortriptyline HCl at different pH
13	nortriptyline HCl	0.1	5	H₂O	ACN-25.4 mmol/L PB （pH 2.5）（40∶60）	230
14	nortriptyline HCl	0.1	5	H₂O	ACN-25.4 mmol/L PB （pH 2.5， c_ChCl=60 mmol/L）（40∶60）	230
15	nortriptyline HCl	0.1	5	H₂O	ACN-20.3 mmol/L PB （pH 4.2）（40∶60）	230
16	nortriptyline HCl	0.1	5	H₂O	ACN-20.3 mmol/L PB （pH 4.2， c_ChCl=60 mmol/L）（40∶60）	230
17	nortriptyline HCl	0.1	5	H₂O	ACN-20.0 mmol/L PB （pH 5.5）（40∶60）	230
18	nortriptyline HCl	0.1	5	H₂O	ACN-20.0 mmol/L PB （pH 5.5， c_ChCl=60 mmol/L）（40∶60）	230
19	nortriptyline HCl	0.1	5	H₂O	ACN-18.2 mmol/L PB （pH 6.5）（40∶60）	230
20	nortriptyline HCl	0.1	5	H₂O	ACN-18.2 mmol/L PB （pH 6.5， c_ChCl=60 mmol/L）（40∶60）	230
Investigation of the effect of ChCl or KCl concentration on the overloading behavior of nortriptyline HCl on analytical column
21	nortriptyline HCl	1	100	H₂O	ACN-13.8 mmol/L PB （pH 2.5， c_ChCl=0-80 mmol/L）（40∶60）	290
22	nortriptyline HCl	1	100	H₂O	ACN-13.8 mmol/L PB （pH 2.5， c_KCl=0-80 mmol/L）（40∶60）	290
Investigation of the effect of DES-A， DES-C， and DES-D on the overloading behavior of nortriptyline HCl on analytical column
23	nortriptyline HCl	1	100	H₂O	ACN-13.8 mmol/L PB （pH 2.5， C_DES-A=20.78 mg/mL）（40∶60）	290
24	nortriptyline HCl	1	100	H₂O	ACN-13.8 mmol/L PB （pH 2.5， C_DES-C=26.54 mg/mL）（40∶60）	290
25	nortriptyline HCl	1	100	H₂O	ACN-13.8 mmol/L PB （pH 2.5， C_DES-D=25.90 mg/mL）（40∶60）	290
Investigation of the effect of ChCl on the chromatographic behavior of berberine HCl on analytical column
26	berberine HCl	1	5， 20， 40， 60， 100	H₂O	ACN-13.8 mmol/L PB （pH 2.5）（35∶65）	290
27	berberine HCl	1	5， 20， 40， 60， 100	H₂O	ACN-13.8 mmol/L PB （pH 2.5， c_ChCl=80 mmol/L）（35∶65）	290
28	berberine HCl	1	5， 20， 40， 60， 100	H₂O	ACN-9.2 mmol/L PB （pH 6.5）（35∶65）	290
Investigation of the effect of ChCl addition on the overloading behavior of benzoic acid on analytical column under different pH
29	benzoic acid	5	50	methanol-H₂O （50∶50）	ACN-40.0 mmol/L H₃PO₄ （pH 2.0）（34∶66）	275
30	benzoic acid	5	50	methanol-H₂O （50∶50）	ACN-40.0 mmol/L H₃PO₄ （pH 2.0， c_ChCl=60 mmol/L ）（34∶66）	275
31	benzoic acid	5	50	methanol-H₂O （50∶50）	ACN-20.3 mmol/L PB （pH 4.2）（29∶71）	275
32	benzoic acid	5	50	methanol-H₂O （50∶50）	ACN-20.3 mmol/L PB （pH 4.2， c_ChCl=60 mmol/L）（29∶71）	275
33	benzoic acid	5	50	methanol-H₂O （50∶50）	ACN-20.0 mmol/L PB （pH 5.5）（11.5∶88.5）	275
34	benzoic acid	5	50	methanol-H₂O （50∶50）	ACN-20.0 mmol/L PB （pH 5.5， c_ChCl=60 mmol/L）（11.5∶88.5）	275
35	benzoic acid	5	50	methanol-H₂O （50∶50）	ACN-18.2 mmol/L PB （pH 6.5）（5∶95）	275
36	benzoic acid	5	50	methanol-H₂O （50∶50）	ACN-18.2 mmol/L PB （pH 6.5， c_ChCl=60 mmol/L）（5∶95）	275
Investigation of the effect of ChCl or KCl on the overloading behavior of benzoic acid on analytical column
37	benzoic acid	0.042， 0.25， 1， 10	50	methanol-H₂O （50∶50）	ACN- 9.2 mmol/L PB （pH 6.5）（5∶95）	290
38	benzoic acid	0.042， 0.25， 1， 10	50	methanol-H₂O （50∶50）	ACN- 9.2 mmol/L PB （pH 6.5， c_ChCl=80 mmol/L）（5∶95）	290
39	benzoic acid	0.042， 0.25， 1， 10	50	methanol-H₂O （50∶50）	ACN- 9.2 mmol/L PB （pH 6.5， c_KCl=80 mmol/L）（5∶95）	290
Investigation of the effect of ChCl or KCl on the overloading behavior of potassium benzoate on analytical column
40	potassium benzoate	13.118，6.559，3.936，2.624，1.312，0.656，0.328，0.164，0.054	50	H₂O	ACN-8.1 mmol/L PB （pH 7.0）（5∶95）	270
41	potassium benzoate	13.118，6.559，3.936，2.624，1.312，0.656，0.328，0.164，0.054	50	H₂O	ACN-8.1 mmol/L PB （pH 7.0， c_KCl=80 mmol/L）（5∶95）	270
42	potassium benzoate	13.118，6.559，3.936，2.624，1.312，0.656，0.328，0.164，0.054	50	H₂O	ACN-8.1 mmol/L PB （pH 7.0， c_ChCl=80 mmol/L）（5∶95）	270
Investigation of the effect of ChCl on the overloading behavior of potassium chlorogenate on analytical column
43	potassium chlorogenate	1.11	5， 20， 40， 60， 100	H₂O	ACN-9.2 mmol/L PB （pH 6.5）（5∶95）	370
44	potassium chlorogenate	1.11	5， 20， 40， 60， 100	H₂O	ACN-9.2 mmol/L PB （pH 6.5， c_ChCl=80 mmol/L）（5∶95）	370
Investigation of the effect of ChCl on the overloading behavior of morroniside on analytical column
45	morroniside	10	40， 80， 100	methanol-9.2 mmol/L PB （pH 6.5）（25∶75）	methanol-9.2 mmol/L PB （pH 6.5）（25∶75）	270
46	morroniside	10	40， 80， 100	methanol-9.2 mmol/L PB （pH 6.5）（25∶75）	methanol-9.2 mmol/L PB （pH 6.5， c_ChCl=80 mmol/L）（25∶75）	270

No.	Compound	Contents/（mg/mL）	Injection volumes/μL	Solvent for working solution	Mobile phase composition	Detection wavelength/nm
Determination of the effect of DESs on the retention factors of nortriptyline HCl and benzoic acid on the analytical column
1	nortriptyline HCl	0.1	5	H₂O	ACN-13.8 mmol/L phosphate buffer （PB， pH 2.5， C_DES-A=20.78 mg/mL）（40∶60. All such ratios are volume ratios， and the same applies hereafter.）	230
2	nortriptyline HCl	0.1	5	H₂O	ACN-13.8 mmol/L PB （pH 2.5， C_DES-B=23.66 mg/mL）（40∶60）	230
3	nortriptyline HCl	0.1	5	H₂O	ACN-13.8 mmol/L PB （pH 2.5， C_DES-C=26.54 mg/mL）（40∶60）	230
4	nortriptyline HCl	0.1	5	H₂O	ACN-13.8 mmol/L PB （pH 2.5， C_DES-D=25.90 mg/mL）（40∶60）	230
5	nortriptyline HCl	0.1	5	H₂O	ACN-13.8 mmol/L PB （pH 2.5， C_DES-E=28.15 mg/mL）（40∶60）	230
6	nortriptyline HCl	0.1	5	H₂O	ACN-13.8 mmol/L PB （pH 2.5， C_ChCl=11.17 mg/mL）（40∶60）	230
7	benzoic acid	0.042	50	methanol-H₂O （50∶50）	ACN-9.2 mmol/L PB （pH 6.5， C_DES-A=20.78 mg/mL）（5∶95）	230
8	benzoic acid	0.042	50	methanol-H₂O （50∶50）	ACN-9.2 mmol/L PB （pH 6.5， C_DES-B=23.66 mg/mL）（5∶95）	230
9	benzoic acid	0.042	50	methanol-H₂O （50∶50）	ACN-9.2 mmol/L PB （pH 6.5， C_DES-C=26.54 mg/mL）（5∶95）	230
10	benzoic acid	0.042	50	methanol-H₂O （50∶50）	ACN-9.2 mmol/L PB （pH 6.5， C_DES-D=25.90 mg/mL）（5∶95）	230
11	benzoic acid	0.042	50	methanol-H₂O （50∶50）	ACN-9.2 mmol/L PB （pH 6.5， C_DES-E=28.15 mg/mL）（5∶95）	230
12	benzoic acid	0.042	50	methanol-H₂O （50∶50）	ACN-9.2 mmol/L PB （pH 6.5， C_ChCl=11.17 mg/mL）（5∶95）	230
Investigation of the effect of ChCl on the retention factor of nortriptyline HCl at different pH
13	nortriptyline HCl	0.1	5	H₂O	ACN-25.4 mmol/L PB （pH 2.5）（40∶60）	230
14	nortriptyline HCl	0.1	5	H₂O	ACN-25.4 mmol/L PB （pH 2.5， c_ChCl=60 mmol/L）（40∶60）	230
15	nortriptyline HCl	0.1	5	H₂O	ACN-20.3 mmol/L PB （pH 4.2）（40∶60）	230
16	nortriptyline HCl	0.1	5	H₂O	ACN-20.3 mmol/L PB （pH 4.2， c_ChCl=60 mmol/L）（40∶60）	230
17	nortriptyline HCl	0.1	5	H₂O	ACN-20.0 mmol/L PB （pH 5.5）（40∶60）	230
18	nortriptyline HCl	0.1	5	H₂O	ACN-20.0 mmol/L PB （pH 5.5， c_ChCl=60 mmol/L）（40∶60）	230
19	nortriptyline HCl	0.1	5	H₂O	ACN-18.2 mmol/L PB （pH 6.5）（40∶60）	230
20	nortriptyline HCl	0.1	5	H₂O	ACN-18.2 mmol/L PB （pH 6.5， c_ChCl=60 mmol/L）（40∶60）	230
Investigation of the effect of ChCl or KCl concentration on the overloading behavior of nortriptyline HCl on analytical column
21	nortriptyline HCl	1	100	H₂O	ACN-13.8 mmol/L PB （pH 2.5， c_ChCl=0-80 mmol/L）（40∶60）	290
22	nortriptyline HCl	1	100	H₂O	ACN-13.8 mmol/L PB （pH 2.5， c_KCl=0-80 mmol/L）（40∶60）	290
Investigation of the effect of DES-A， DES-C， and DES-D on the overloading behavior of nortriptyline HCl on analytical column
23	nortriptyline HCl	1	100	H₂O	ACN-13.8 mmol/L PB （pH 2.5， C_DES-A=20.78 mg/mL）（40∶60）	290
24	nortriptyline HCl	1	100	H₂O	ACN-13.8 mmol/L PB （pH 2.5， C_DES-C=26.54 mg/mL）（40∶60）	290
25	nortriptyline HCl	1	100	H₂O	ACN-13.8 mmol/L PB （pH 2.5， C_DES-D=25.90 mg/mL）（40∶60）	290
Investigation of the effect of ChCl on the chromatographic behavior of berberine HCl on analytical column
26	berberine HCl	1	5， 20， 40， 60， 100	H₂O	ACN-13.8 mmol/L PB （pH 2.5）（35∶65）	290
27	berberine HCl	1	5， 20， 40， 60， 100	H₂O	ACN-13.8 mmol/L PB （pH 2.5， c_ChCl=80 mmol/L）（35∶65）	290
28	berberine HCl	1	5， 20， 40， 60， 100	H₂O	ACN-9.2 mmol/L PB （pH 6.5）（35∶65）	290
Investigation of the effect of ChCl addition on the overloading behavior of benzoic acid on analytical column under different pH
29	benzoic acid	5	50	methanol-H₂O （50∶50）	ACN-40.0 mmol/L H₃PO₄ （pH 2.0）（34∶66）	275
30	benzoic acid	5	50	methanol-H₂O （50∶50）	ACN-40.0 mmol/L H₃PO₄ （pH 2.0， c_ChCl=60 mmol/L ）（34∶66）	275
31	benzoic acid	5	50	methanol-H₂O （50∶50）	ACN-20.3 mmol/L PB （pH 4.2）（29∶71）	275
32	benzoic acid	5	50	methanol-H₂O （50∶50）	ACN-20.3 mmol/L PB （pH 4.2， c_ChCl=60 mmol/L）（29∶71）	275
33	benzoic acid	5	50	methanol-H₂O （50∶50）	ACN-20.0 mmol/L PB （pH 5.5）（11.5∶88.5）	275
34	benzoic acid	5	50	methanol-H₂O （50∶50）	ACN-20.0 mmol/L PB （pH 5.5， c_ChCl=60 mmol/L）（11.5∶88.5）	275
35	benzoic acid	5	50	methanol-H₂O （50∶50）	ACN-18.2 mmol/L PB （pH 6.5）（5∶95）	275
36	benzoic acid	5	50	methanol-H₂O （50∶50）	ACN-18.2 mmol/L PB （pH 6.5， c_ChCl=60 mmol/L）（5∶95）	275
Investigation of the effect of ChCl or KCl on the overloading behavior of benzoic acid on analytical column
37	benzoic acid	0.042， 0.25， 1， 10	50	methanol-H₂O （50∶50）	ACN- 9.2 mmol/L PB （pH 6.5）（5∶95）	290
38	benzoic acid	0.042， 0.25， 1， 10	50	methanol-H₂O （50∶50）	ACN- 9.2 mmol/L PB （pH 6.5， c_ChCl=80 mmol/L）（5∶95）	290
39	benzoic acid	0.042， 0.25， 1， 10	50	methanol-H₂O （50∶50）	ACN- 9.2 mmol/L PB （pH 6.5， c_KCl=80 mmol/L）（5∶95）	290
Investigation of the effect of ChCl or KCl on the overloading behavior of potassium benzoate on analytical column
40	potassium benzoate	13.118，6.559，3.936，2.624，1.312，0.656，0.328，0.164，0.054	50	H₂O	ACN-8.1 mmol/L PB （pH 7.0）（5∶95）	270
41	potassium benzoate	13.118，6.559，3.936，2.624，1.312，0.656，0.328，0.164，0.054	50	H₂O	ACN-8.1 mmol/L PB （pH 7.0， c_KCl=80 mmol/L）（5∶95）	270
42	potassium benzoate	13.118，6.559，3.936，2.624，1.312，0.656，0.328，0.164，0.054	50	H₂O	ACN-8.1 mmol/L PB （pH 7.0， c_ChCl=80 mmol/L）（5∶95）	270
Investigation of the effect of ChCl on the overloading behavior of potassium chlorogenate on analytical column
43	potassium chlorogenate	1.11	5， 20， 40， 60， 100	H₂O	ACN-9.2 mmol/L PB （pH 6.5）（5∶95）	370
44	potassium chlorogenate	1.11	5， 20， 40， 60， 100	H₂O	ACN-9.2 mmol/L PB （pH 6.5， c_ChCl=80 mmol/L）（5∶95）	370
Investigation of the effect of ChCl on the overloading behavior of morroniside on analytical column
45	morroniside	10	40， 80， 100	methanol-9.2 mmol/L PB （pH 6.5）（25∶75）	methanol-9.2 mmol/L PB （pH 6.5）（25∶75）	270
46	morroniside	10	40， 80， 100	methanol-9.2 mmol/L PB （pH 6.5）（25∶75）	methanol-9.2 mmol/L PB （pH 6.5， c_ChCl=80 mmol/L）（25∶75）	270

No.	Sample	Content/（mg/mL）	Injection volume/μL	Solvent for working solution	Mobile phase composition	Detection wavelengths/nm
1	Coptis chinensisextracts	100	100	methanol-H₂O （50∶50）	ACN-9.2 mmol/L PB （pH 6.5）（35∶65）	290
2	Coptis chinensisextracts	100	100	methanol-H₂O （50∶50）	ACN-9.2 mmol/L PB （pH 6.5， c_ChCl=80 mmol/L）（35∶65）	290
3	Lonicera Japonica extracts	100	50	aqueous KOH solution	ACN-9.2 mmol/L PB （pH 6.5）（5∶95）	350
4	Lonicera Japonica extracts	100	50	aqueous KOH solution	ACN-9.2 mmol/L PB （pH 6.5， c_ChCl=80 mmol/L）（5∶95）	350
5	Cornus officinalis extracts	100	100	mobile phase	methanol-9.2 mmol/L PB （pH 6.5）（25∶75）	254/270
6	Cornus officinalis extracts	100	100	mobile phase	methanol-9.2 mmol/L PB （pH 6.5， c_ChCl=80 mmol/L）（25∶75）	254/270