Preparation and chiral separation performance evaluation of a high performance liquid chromatography stationary phase based on a ［2+4］-type chiral porous organic cage Pim

doi:10.3724/SP.J.1123.2026.01017

Abstract

Abstract:

Porous organic cages （POCs） represent a class of emerging porous materials assembled from discrete three-dimensional cage-like molecules via intermolecular interactions. Owing to their good solubility and unique pore structures， they show great potential in gas adsorption， molecular recognition， separation， catalysis， and sensing. In this study， a phenolphthalein-based tetraaldehyde compound was synthesized via the Duff reaction using phenolphthalein as the substrate and trifluoroacetic acid （TFA） combined with hexamethylenetetramine （HMTA） as the formylation reagent. Subsequently， a ［2+4］-type chiral imine POC， Pim （C₇₂H₆₈N₈O₈）， was constructed by reacting the tetraaldehyde precursor with （1R，2R）-（-）-1，2-diaminocyclohexane via imine condensation. The synthesized Pim was functionalized with alkenyl groups using 5-bromo-1-pentene and then immobilized onto thiol-modified silica via thiol-ene click chemistry to afford a novel chiral stationary phase （CSP） for high performance liquid chromatography （HPLC）. The successful syntheses of tetraaldehyde compound， Pim， and CSP were characterized by nuclear magnetic resonance （NMR）， fourier transform infrared spectroscopy （FT-IR）， electrospray ionization mass spectrometry （ESI-MS）， thermogravimetric analysis （TGA）， and elemental analysis （EA）. The chiral separation performance of this CSP was evaluated under both normal-phase （NP） and reversed-phase （RP） HPLC separation modes. The results demonstrated that the CSP exhibits excellent chiral separation capabilities in both two separation modes. Under NP-HPLC conditions， ten racemates were resolved， including five with baseline separation. Under RP-HPLC conditions， nine racemates were resolved， of which eight achieved baseline separation. Furthermore， this CSP exhibits good chiral separation complementarity with two widely used commercial columns， Chiralpak AD-H and Chiralcel OD-H， showing the ability to resolve some chiral compounds that cannot be resolved or are poorly resolved by the two commercial columns. The effects of analyte injection mass and column temperature on chiral separation performance of the column were also investigated. Additionally， the prepared HPLC column exhibits good repeatability and stability. After hundreds of injections， no significant changes were observed in the retention times and resolutions compared to its initial performance， with relative standard deviations （RSDs， n=5） of ≤1.50% and ≤1.92%， respectively. Meanwhile， after the column was placed and stored for one month， its separation performance showed no significant change compared with that at the initial stage of column use， and the RSDs （n=3） of retention time and resolution were ≤1.88% and ≤2.26%， respectively. This study confirms that the chiral POC Pim is a promising material for HPLC chiral separation， providing significant theoretical and experimental support for the development of novel POC-based CSPs and holding great significance for expanding the POC-based CSPs.

Key words: high performance liquid chromatography （HPLC）, chiral stationary phase （CSP）, enantioseparation, chiral porous organic cage

CLC Number:

O658

CHEN Chun, GONG Yanan, WANG Bangjin, XIE Shengming, ZHANG Junhui, YUAN Liming. Preparation and chiral separation performance evaluation of a high performance liquid chromatography stationary phase based on a ［2+4］-type chiral porous organic cage Pim[J]. Chinese Journal of Chromatography, 2026, 44(10): 1212-1222.

Figures/Tables 13

Fig. 1 Synthesis of ［2+4］-type chiral porous organic cage （POC） PimHMTA： hexamethylenetetramine； TFA： trifluoroacetic acid； EtOH： ethanol； MeCN： acetonitrile.

Fig. 2 Preparation of CSP SiO2-SH： thiolated silica； AIBN： azobisisobutyronitrile； CSP： chiral stationary phase.

Fig. 3 ESI-MS spectrum of Pim

Fig. 4 （a）FT-IR spectra of Pim， SiO2-SH and CSP；（b） TGA curves of SiO2， SiO2-SH and CSP

Table 1 Elemental analysis data of SiO2-SH and CSP

Sample	Contents/%
Sample	C	H	N
SiO₂-SH	4.791	0.305	<0.05%
CSP	18.458	1.941	1.920

Fig. 5 Chromatograms of racemates on the Pimcolumn under NP-HPLC

Table 2 Separation data of racemates on the Pim， Chiralpak AD-H， and Chiralcel OD-H columns under NP-HPLC

Racemate	Pim			Chiralpak AD-H			Chiralcel OD-H
Racemate	k₁	α	R_s	k₁	α	R_s	k₁	α	R_s
4-Fluoro-α-methylbenzylamine	0.75	1.53	2.64	1.62	1.00	-	0.93	1.13	0.73
Styrene oxide	0.63	1.52	2.48	0.41	1.10	0.50	0.64	1.00	-
Ethyl mandelate	1.26	1.34	1.95	1.92	1.08	1.63	1.45	2.04	7.68
1-Phenyl-1-pentanol	0.17	1.57	1.12	0.78	1.00	-	0.74	1.00	-
2-Methoxy-2-phenylethanol	0.43	1.30	1.14	0.91	1.23	2.70	0.81	1.13	0.69
Benzoin	1.38	3.45	10.35	4.54	1.34	6.35	2.52	1.58	6.53
4-Methylbenzhydrol	1.27	1.46	2.44	1.66	1.11	1.48	1.74	1.14	1.27
1-（4-Fluorophenyl）ethanol	1.08	1.17	0.96	0.83	1.00	-	0.74	1.00	-
Benzoin ethyl ether	0.53	1.20	0.92	0.82	1.17	2.31	0.39	1.17	1.52
Troger’s base	2.90	1.07	0.53	0.66	1.83	6.99	1.07	1.26	1.71

Table 3 Separation data of racemates on the Pim， Chiralpak AD-H， and Chiralcel OD-H columns under RP-HPLC

Racemate	Pim			Chiralpak AD-H			Chiralcel OD-H
Racemate	k₁	α	R_s	k₁	α	R_s	k₁	α	R_s
4，4′-Dimethylbenzoin	0.99	1.66	2.87	5.06	1.10	2.74	1.69	1.36	2.39
1-（4-Fluorophenyl）ethanol	0.57	1.35	1.36	0.83	1.00	-	0.74	1.00	-
1-Phenyl-1-pentanol	0.82	1.57	2.90	0.78	1.00	-	0.74	1.00	-
1-Phenylethanol	0.60	1.40	1.79	0.84	1.00	-	0.90	1.22	1.29
Zopiclone	0.90	2.73	9.46	1.71	1.00	-	2.09	1.00	-
4-Chlorobenzhydrol	0.59	1.38	1.77	1.65	1.14	2.01	2.05	1.00	-
Styrene oxide	1.19	1.40	2.60	0.41	1.10	0.50	0.64	1.00	-
2-Methoxy-2-phenylethanol	1.71	1.26	2.41	0.91	1.23	2.70	0.81	1.13	0.69
Benzoin	0.83	1.49	1.91	4.54	1.34	6.35	2.52	1.58	6.53

Fig. 6 Chromatograms of racemates on the Pimcolumn under RP-HPLC

Fig. 7 Effect of column temperature on the chiral separation performance of Pim columna. enantioseparation of 4-fluoro-α-methylbenzylamine under NP-HPLC at different column temperatures. Other chromatographic conditions are the same as those in Table 2. b. van’t Hoff plots of 4-fluoro-α-methylbenzylamine； c. enantioseparation of benzoin under RP-HPLC at different column temperatures. Other chromatographic conditions are the same as those in Table 3； d. van’t Hoff plots of benzoin.

Table 4 Thermodynamic values for the resolution of 4-fluoro- α -methylbenzylamine under NP-HPLC and benzoin under RP-HPLC

Analyte	ΔH/（kJ/mol）	ΔS/（J/（mol·K））	ΔG/（kJ/mol）	R²
D-4-Fluoro-α-methylbenzylamine	-14.77±0.33	-45.94±1.10	-1.08±0.33	0.9980
L-4-Fluoro-α-methylbenzylamine	-14.96±0.33	-42.89±1.10	-2.17±0.33	0.9980
R-Benzoin	-8.58±0.22	-24.24±0.71	-1.35±0.22	0.9975
S-Benzoin	-10.38±0.19	-27.07±0.63	-2.31±0.19	0.9987

Fig. 8 Effect of injection mass on the chiral separation performance of Pim columna， b. enantioseparation of 4-fluoro-α-methylbenzylamine under NP-HPLC with different injection masses. Other chromatographic conditions are the same as those in Table 2. c， d. enantioseparation of benzoin under RP-HPLC with different injection masses. Other chromatographic conditions are the same as those in Table 3.

Fig. 9 Repeatability and stability of Pim columnFor enantioseparation of 4-fluoro-α-methylbenzylamine under NP-HPLC， chromatographic conditions are the same as those in Table 2. For enantioseparation of benzoin under RP-HPLC， chromatographic conditions are the same as those in Table 3.

References

[1]	Huang B， Li K， Ma Q Y， et al. Anal Chem， 2023， 95（35）： 13289
[2]	Qian H L， Xu S T， Yan X P. Anal Chem， 2023， 95： 304
[3]	Li H， Wang X P， Shi C X， et al. Chin Chem Lett， 2023， 34（3）： 107606
[4]	Zhang J H， Xie S M， Yuan L M. J Sep Sci， 2022， 45（1）： 51
[5]	Zhang J H， Liang R X， Huang B， et al. Chin Chem Lett， 2026， 37（1）： 111146
[6]	Sun G， Luo Y， Yan Z， et al. Chin Chem Lett， 2024， 35（12）： 109787
[7]	Zheng D S， Tang W Q， Zhu J P， et al. Chinese Journal of Chromatography， 2024， 42（6）： 524
	郑德圣，汤雯淇，朱建平，等. 色谱， 2024， 42（6）： 524
[8]	Yang M F， Zheng K N， Long Y X， et al. Chinese Journal of Chromatography， 2025， 43（4）： 335
	杨梅芳，郑康妮，龙怡幸，等. 色谱， 2025， 43（4）： 335
[9]	Tang W Q， Cheng Y， Zhu J P， et al. Angew Chem Int Ed， 2024， 63（42）： e202409588
[10]	Qian H L， Yang C X， Yan X P. Nat Commun， 2016， 7： 12104
[11]	Tang B， Wang W， Hou H， et al. Chin Chem Lett， 2022， 33（2）： 898
[12]	Zhou S Q， Kuang Y X， Zheng J， et al. Chinese Journal of Chromatography， 2024， 42（1）： 1
	周素馨，况逸馨，郑娟，等. 色谱， 2024， 42（1）： 1
[13]	Yuan C， Wang Z， Xiong W Q， et al. J Am Chem Soc， 2023， 145（34）： 18956
[14]	Li X， Cui Y Y， Yang C X. Talanta， 2021， 224： 121914
[15]	Tozawa T， Jones J T A， Swamy S I， et al. Nat Mater， 2009， 8（12）： 973
[16]	Mastalerz M. Angew Chem Int Ed， 2010， 49（30）： 5042
[17]	Yang X C， Ullah Z， Stoddart J F， et al. Chem Rev， 2023， 123： 4602
[18]	Wang H， Jin Y， Sun N， et al. Chem Soc Rev， 2021， 50（16）： 8874
[19]	Kong Q D， Liu L L， Li Z Y. Chem Eur J， 2024， 30： e202400947
[20]	Cao X， Jin Y， Wang H， et al. Chin Chem Lett， 2024， 35（9）： 109201
[21]	Zhao X， Cui H Y， Guo L L， et al. Angew Chem Int Ed， 2024， 63（47）： e202411613
[22]	Mohan M， Pham D-J， Fluck A， et al. Chem Eur J， 2024， 30： e202400458
[23]	Zhang Z Y， Ying Y， Li Y F， et al. Angew Chem Int Ed， 2026， 65（3）： e22364
[24]	Guo Z X， Kong W X， Zhou L Y， et al. ACS Catal， 2025， 15： 3955
[25]	Xu Y， Dai C， Xu Z F. Talanta， 2025， 286： 127518
[26]	Kelabi D A， Dey A， Alimi L O， et al. Chem Sci， 2022， 13： 7341
[27]	Zhang J H， Xie S M， Chen L， et al. Anal Chem， 2015， 87（15）： 7817
[28]	Xie S M， Zhang J H， Fu N， et al. Anal Chim Acta， 2016， 903： 156
[29]	Zhang J H， Xie S M， Wang B J， et al. J Chromatogr A， 2015， 1426： 174
[30]	Wang Y， Li H X， Xie S M， et al. Microchem J， 2021， 170： 106650
[31]	Huang B， Chen J， Wang B J， et al. Chinese Journal of Chromatography， 2024， 42（9）： 891
	黄斌，陈娟，王帮进，等. 色谱， 2024， 42（9）： 891
[32]	Wang Y， Chen J K， Xiong L X， et al. Anal Chem， 2022， 94（12）： 4961
[33]	Zhang H C， Zhang J H， Gong Y N， et al. Chem Eur J， 2025， 31（31）： e202500977
[34]	Liang R X， Zhang Y P， Zhang J H， et al. J Chromatogr A， 2023， 1711： 464444
[35]	Li Z， Tang Z， Cao J， et al. J Chromatogr A， 2024， 1737： 465441
[36]	Jiang Z， Zhang G， Yang Y， et al. J Chromatogr A， 2025， 1740： 465561
[37]	Zhang L， Jia Y， Meng F S， et al. Dyes Pigments， 2022， 206： 110578
[38]	Yao X， Tan T T， Wang Y. J Chromatogr A， 2014， 1326： 80
[39]	Siles B A， Halsall H B， Dorsey J G. J Chromatogr A， 1995， 704： 289